【摘要】 毛發酸解法提取氨基酸產生的污水是較難處理的工業污水之一，然而此類污水中又含有很多寶貴的資源。本研究利用高鹽毛發酸解液污水生產飼用酵母，將污水中的資源轉化為菌體蛋白，既回收大量有用物質，同時使污水達排放標準。首先，研究選用了5種微生物菌體吸附污水中的重金屬離子。結果冬蟲夏草菌對Cr吸附率最高，達96.4%，可使重金屬達排放標準。其次，探索了物理化學、生物吸附法去除污水中的色素及Cl-。結果色素可被有效吸附，活性炭對其吸附率達66.2%。接著，選取12種飼料生產菌進行耐鹽性馴化篩選，結果產朊假絲酵母能在N含量4.8%(w/v)的污水培養基中生長，在N含量3.2%(w/v)的污水培養基中形成菌落僅需2d。對其進行培養條件優化，結果為：培養時間3d，裝液量50mL/250mL三角瓶，初始pH5.5，污水N含量3.2%(w/v)，玉米淀粉(酶解液)11%(w/v)，K2HPO42.0%(w/v)，酵母粉0.9%(w/v)，FeSO40.2%(w/v)，MgSO40.9%(w/v)，CaCO30.2%(w/v)，菌體得率達4.1%(w/v)，較優化前提高了128.7%。發酵后，污水中N含量降低了23.3%。說明產朊假絲酵母利用了污水中的部分營養成分，大大降低了飼用產朊假絲酵母的發酵成本，同時也減小了污水處理難度。最后，我們另從高鹽環境中篩選到一株能在污水培養基中生長的酵母菌，用分子生物學方法鑒定為飼用漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。經馴化后該菌能在N含量4.8%(w/v)的污水培養基中生長，在N含量3.2%(w/v)的污水培養基中形成菌落僅需1d。對其進行培養條件優化，結果為：裝液量50mL/250mL三角瓶，初始pH5.0，種齡4d，培養時間5d，接種量10%(w/v)，污水N含量3.2%(w/v)，玉米淀粉(酶解液)7%(w/v)，KH2PO41.5%(w/v)，酵母粉0.3%(w/v)，FeSO40.6%(w/v)，MgSO40.5%(w/v)，CaCO30.2%(w/v)，菌體得率達4.9%(w/v)(相當于N含量9.67%(w/v)的高鹽污水可轉化成14.7%(w/v)的飼用菌體)，較優化前提高了48.5%。發酵后，毛發酸解液污水N含量降低了82.3%，達到了較好的處理效果。 

第 1 章 緒 論

 

1.1 我國水污染現狀

據調查，世界上能喝到安全飲用水的人不到 30%，每天約有 2.5 萬人死于與水污染相關的疾病[1]。預計到 2050 年，世界上會有約 70 億人面臨缺水的問題[2]。2011年我國水資源總量[3]為 23256.7 億 m3，為 1956 年以來最少的一年。人口數量的增長、農藥噴灑、工業廢水的亂排亂放等，造成了淡水資源的加劇短缺。工業污水為水污染的主要來源之一[3]，占污水排放總量的 32.3%。但是這只是官方統計數據，實際上，其排放量大大超過此數值[4]，因為許多企業工業污水排放量難以統計。

 

1.2 氨基酸廠廢水特點

 

氨基酸工業污水有機物含量高、氨氮含量高、鹽分高、酸性強，處理難度較大[5-7]。目前，生產氨基酸的企業大部分用強酸酸解人或動物的毛發，生產氨基酸單體工藝流程見圖 1.1。呂墩氨基酸廠用毛發酸解法提取氨基酸的污水成分和理化性質參見表 1.1、表 1.2。

 

第 2 章 菌體吸附法去除毛發酸解液污水中重金屬的研究

 

2.1 引言
重金屬毒性大，在環境中不易被代謝，而且可以通過食物鏈被生物富集和生物放大[50-52]，一旦未經處理排放到自然界中，將極大地破壞生態系統，嚴重威脅水生生物的生存和人類的健康。本實驗選用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)、白地霉(Geotrichum candidum)、冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)這 5 種吸附重金屬能力較強的菌[53-57]，吸附污水中的 Pb、As、Hg、Cd、Cr。由于呂墩氨基酸廠污水中只有 Cr 超過了污水排放標準，因此，實驗選取 Cr 為檢測標準，篩選出重金屬高效吸附菌。

 

2.2 實驗材料

2.2.1 菌種

2.2.1.1 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC 31362

2.2.1.2 冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis) CCTCC AF99009

2.2.1.3 根霉(Rhizopus) 湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室
2.2.1.4 毛霉(Mucor) 湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室

2.2.1.5 白地霉(Geotrichum candidum) CICC 32260

2.2.2 主要儀器與設備

 

第 3 章 物理化學、生物吸附法處理毛發酸解液污水的研究.....14

3.1 引言.............................................................................14

3.2 實驗材料...................................................................... 14

3.2.1 菌種 ......................................................................... 14

3.2.2 主要儀器與設備...........................................................14

3.2.3 主要試劑 ................................................................... 15

3.2.4 溶液及培養基.............................................................. 15

3.3 實驗方法........................................................................ 16

3.3.1 色度檢測 .....................................................................16

3.3.2 Cl-檢測.........................................................................16

3.3.3 冬蟲夏草菌的制備........................................................ 16

3.3.4 冬蟲夏草菌處理毛發酸解液污水.....................................16

3.3.5 活性炭處理毛發酸解液污水............................................16

3.3.6 殼聚糖處理毛發酸解液污水............................................17

3.3.7 聚丙烯酰胺處理毛發酸解液污水..................................... 17

3.4 結果與分析.......................................................................17

3.4.1 Cl-標準曲線....................................................................17

3.4.2 冬蟲夏草菌處理毛發酸解液污水效果.................................18

3.4.3 活性炭處理毛發酸解液污水效果........................................18

3.4.4 殼聚糖處理毛發酸解液污水效果....................................... 20

3.4.5 聚丙烯酰胺處理毛發酸解液污水效果..................................20

3.5 結論................................................................................... 20

第 4 章 利用高鹽毛發酸解液污水生產飼用產朊假絲酵母的研究......21

4.1 引言.................................................................................... 21

4.2 實驗材料.............................................................................. 21

4.2.1 實驗菌種 ...........................................................................21

4.2.2 主要儀器與設備................................................................. 22

4.2.3 主要試劑 .......................................................................... 22

4.2.4 溶液及培養基......................................................................23

4.3 實驗方法.............................................................................. 24

4.3.1 玉米淀粉預處理.................................................................. 24

4.3.2 還原糖檢測..........................................................................24

4.3.3 菌種篩選 ........................................................................... 24

4.3.4 菌種馴化 ........................................................................... 24

4.3.5 紫外誘變 ............................................................................ 24

4.3.6 種子培養 ............................................................................ 25

4.3.7 生長曲線的測定.................................................................... 25

4.3.8 裝液量對高耐鹽菌株生長的影響............................................. 25

4.3.9 初始 pH 對高耐鹽菌株生長的影響............................................26

4.3.10 培養基成分優化................................................................... 26

4.3.11 高耐鹽菌株處理毛發酸解液污水效果...................................... 26

4.4 結果與分析................................................................................26

4.4.1 還原糖標準曲線...................................................................... 26

4.4.2 菌種篩選結果.......................................................................... 27

4.4.3 菌種馴化結果........................................................................... 27

4.4.4 紫外誘變結果........................................................................... 27

4.4.5 產朊假絲酵母生長曲線的測定.................................................... 29

4.4.6 裝液量對產朊假絲酵母生長的影響...............................................29

4.4.7 初始 pH 對產朊假絲酵母生長的影響........................................... 30

4.4.8 培養基成分優化......................................................................... 30 

4.4.9 產朊假絲酵母處理毛發酸解液污水效果........................................ 36

4.5 結論..............................................................................................37

第 5 章 利用高鹽毛發酸解液污水生產飼用漢遜德巴利酵母的研究............38

5.1 引言............................................................................................. 38

5.2 實驗材料...................................................................................... 38

5.2.1 實驗菌種 ....................................................................................38

5.2.2 主要儀器與設備.......................................................................... 38

5.2.3 主要試劑 ................................................................................... 39

5.2.4 引物 .......................................................................................... 40

5.2.5 溶液及培養基.............................................................................. 40

5.3 實驗方法........................................................................................ 41

5.3.1 玉米淀粉預處理........................................................................... 41

5.3.2 還原糖檢測.................................................................................. 41

5.3.3 菌種篩選..................................................................................... 41

5.3.4 菌種馴化 ......................................................................................41

5.3.5 高耐鹽酵母菌的分子生物學鑒定..................................................... 41

5.3.6 種子培養 ..................................................................................... 43

5.3.7 生長曲線的測定............................................................................. 43

5.3.8 裝液量對耐鹽酵母菌生長的影響.......................................................44

5.3.9 初始 pH 對耐鹽酵母菌生長的影響................................................... 44

5.3.10 種齡、搖瓶發酵時間及接種量的優化.............................................. 44

5.3.11 培養基成分優化............................................................................ 44

5.4 結果與討論........................................................................................ 45

5.4.1 還原糖標準曲線繪制........................................................................ 45

5.4.2 篩選馴化結果.................................................................................. 45

5.4.3 分子鑒定結果................................................................................... 46

5.4.4 生長曲線的測定................................................................................ 52

5.4.5 裝液量對漢遜德巴利酵母生長的影響................................................... 52

5.4.6 初始 pH 對漢遜德巴利酵母生長的影響................................................ 52 

5.4.7 種齡、搖瓶發酵時間及接種量正交試驗結果......................................... 53

5.4.8 培養基成分優化................................................................................. 54

5.4.9 漢遜德巴利酵母處理毛發酸解液污水效果............................................. 55

5.5 結論..................................................................................................... 56

 

第 5 章 利用高鹽毛發酸解液污水生產飼用漢遜德巴利酵母的研究

 

5.1 引言

采集高鹽環境的水樣、土樣，培養于高濃度毛發酸解液污水培養基中，以期篩選出對高鹽污水具有高耐受力的優勢飼用酵母菌株，將氨基酸轉化為菌體蛋白，降低污水中的 N 含量，凈化污水的同時，做到廢物回收再利用。本章從高鹽環境中篩選出的酵母菌, 再通過連續馴化培養進一步提高其耐鹽能力，獲得一株高耐鹽酵母菌。運用了分子生物學方法，檢測與分析從高鹽環境中篩選出的酵母菌的 18SrDNA、26S rDNA 及 ITS 序列，鑒定其為可飼用的漢遜德巴利酵母，隨后探索其最優生長條件，大幅提高其了對污水中氮源的利用能力。

 

5.2 實驗材料

5.2.1 實驗菌種大腸桿菌 Top 10 湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室

 

第 6 章 結論及展望

 

6.1 結論

⑴ 研究用 5 種微生物菌體吸附毛發酸解液污水中的微量重金屬離子。結果冬蟲夏草菌對 Cr 吸附率最高，達 96.4%，可使重金屬達排放標準。⑵ 探究物理化學、生物吸附法去除污水中的色素及 Cl-。結果冬蟲夏草菌、活性炭、聚丙烯酰胺及殼聚糖均不能有效去除高濃度 Cl-；活性炭吸附色素的效果較好，吸附率達 66.2%。⑶ 選取 12 種飼料生產菌進行耐鹽性馴化篩選，結果產朊假絲酵母能夠在 N含量為 4.8% (w/v)的污水培養基中生長，在 N 含量為 3.2% (w/v)的污水培養基中 2d 即可長出菌落。對產朊假絲酵母的培養條件進行優化，結果為：培養時間 3 d，裝液量 50 mL/250 mL 三角瓶，初始 pH5.5，污水 N 含量 3.2% (w/v)，玉米淀粉(酶解液)11% (w/v)，K2HPO42.0% (w/v)，酵母粉 0.9% (w/v) ，FeSO40.2% (w/v)，MgSO40.9% (w/v)，CaCO30.2% (w/v)。在此條件下，菌體得率可達 4.1% (w/v)，較優化前提高了 128.7%。經產朊假絲酵母發酵后，污水 N 含量降低了 23.3%；添加的 11%(w/v)玉米淀粉酶解液經微生物部分吸收，部分分解后，上清還原糖仍有 3.78%(w/v)。⑷ 進一步從高鹽環境中篩選鑒定到一株能在高濃度污水培養基中生長的漢遜德巴利酵母。經馴化，該菌能在 N 含量為 4.8% (w/v)的污水培養基中生長，在 N含量為 3.2% (w/v)的污水培養基中長出菌落僅需 1 d。其培養條件優化結果為：培養時間 5 d，裝液量 50 mL/250 mL 三角瓶，初始 pH5.0，種齡 4 d，接種量 10% (w/v)，污水 N 含量 3.2% (w/v)，玉米淀粉酶解液 7% (w/v)，KH2PO41.5% (w/v)，酵母粉0.3% (w/v)，FeSO40.6% (w/v)，MgSO40.5% (w/v)，CaCO30.2% (w/v)。在此條件下，菌體得率可達 4.9% (w/v)，較優化前提高了 48.5%。經發酵后，污水中的含 N量降低了 82.3%；還原糖殘留量 3.09% (w/v)。同產朊假絲酵母相比，漢遜德巴利酵母培養基中添加的營養物質更少，成本更低，而且對污水中的 N 源利用率更高，處理效果更好。

 

參考文獻:

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本文編號：9584