血栓栓塞性疾病是當前危害人類健康導致死亡的主要原因之一。防栓和溶栓是防治該病的關鍵。目前，國產正式應用于臨床的溶栓藥暫限于人尿激酶(Urokinase,UK)，鏈激酶(Streptokinase,SK)，而尿激酶和鏈激酶的溶栓效率有限且因無纖維蛋白溶解特異性，易發生治療性出血。組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,t-PA)是人血液中天然纖溶系統激活劑，與尿激酶和鏈激酶相比，人t-PA與血栓基質有很高的特異性親和力。它能在血栓局部激活纖維蛋白原使其轉化成具有生物活性的纖維蛋白酶，后者可水解血栓的基質——纖維蛋白，使凝血塊溶解，血管再通，并且不引起血纖溶系統性激活，因而大大降低了治療過程中出血的危險，是一種用于治療急性心肌梗塞等血栓性疾病的特效藥物。t-PA除了參與體內溶血和凝血的平衡調控外，還與其它一些重要的生理與病理過程密切相關，如組織再造、細胞遷移、排卵、補體激活、激肽產生，腫瘤侵襲等。 正常人體組織內，t-PA分布廣，但含量非常低，如在血液中只有4-20μg/L。在人體內半衰期短，僅4～5分鐘。因此從天然材料中很難大量制備t-PA，用于治療甚至研究。通過基因工程手段獲取大量t-PA是一條很有希望的途徑。生產重組蛋白的方法各有優缺點。大腸桿菌缺乏修飾酶類，真核生物蛋白翻譯后無法進行磷酸化、酰胺化等加工修飾，不能正確折疊，缺乏分泌作用形成無活性包含體。借助逆轉錄病毒載體將目的基因導入細胞有潛在致癌性，并引起宿主病毒感染的可能。酵母提純工藝復雜、成本高，產品純度達不到要求。構建高效表達載體以期得到高表達細胞株，是生產重組蛋白的有效方法。pcDNA3真核表達載體是構建基因表達重組體的有效載體，可在哺乳動物細胞中穩定持續表達。SV40 鄭州大學2003屆研究生論文 組織型纖溶酶原激活劑(t一隊)真核表達載體的構建 啟動子和CMv啟動子都是強啟動子，本實驗將t一PAcDNA置于SV40和CMV 啟動子調控之下，構建了真核表達載體pcDNA3一t一PA，為下一步研究轉基因動物 生產t~PA奠定了基礎。 材料和方法:以含t一PAcDNA的質粒PETPFR為模板，設計上下游引物(引物 兩端分別帶Hindm和Sall酶切位點)，PCR擴增t一PA，用限制性內切酶Hindm 和sall雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收2.Ikbt一PA酶切片段。PcDNA3用限制性 內切酶Hindln和刀101雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收5.4kb酶切片段。Sall和 乃01的粘性末端互補。爪DNA hgase體外連接2.Ikb和5.4kb片段，16℃，過夜。 重組體轉化感受態JM 109細菌。將轉化菌涂于含Amp的培養平皿，37℃溫箱培 養過夜。隨機挑選10個克隆，接種于含Amp的LB培養基，37℃培養過夜，小 提質粒，酶切鑒定。限制性內切酶Hindm單酶切，得到7.skb片段，Hindm和 Xbal雙酶切得到 5.4kb和2.Ikb片段，初步鑒定為陽性重組體。序列測定插入 片段正確。重組pcDAN3一t一PA真核表達載體與脂質轉染胺試劑 L幣。fectamineTMZooo混合轉染乳腺癌(McF一7)細胞，G418篩選陽性細胞，獲得 了MCF一7陽性細胞系。 結果: 1.陽性重組質粒Hindm單酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示為7.skb條帶，Hindm和 Xbal雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示為5.4kb和2.Ikb條帶。 2.插入片段序列測定正確，真核表達載體PcDNA3一t一PA構建成功。 3.脂質轉染胺試劑LIPofectamin矛M2000介導轉染McF一7細胞，G418篩選，獲得 了MCF一7陽性細胞系。 結論: 1.本實驗將t一PAcDNA置于SV40和CMv強啟動子調控之下，成功構建了真核 表達載體peDNA3一t一PA，為下一步研究轉基因動物生產t一PA奠定了基礎。 2.建立了表達組織纖溶酶原激活劑任PA)的MCF一7陽性細胞系。 本實驗構建的組織型纖溶酶原激活劑(t一PA)真核表達載體為在哺乳動物細 胞和轉基因動物表達研究奠定了基礎，成為生產高效溶栓藥t一PA的有效方法。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
論文部分 組織型溶酶原激活劑（t-PA）真核表達載體的構建
    中文摘要
    英文摘要
    前言
    材料與方法
    結果
    附圖
    討論
    小結
    參考文獻
綜述部分 組織型纖溶酶原激活劑研究進展
    參考文獻
英文縮寫詞
致謝

【參考文獻】

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1 楊肅文,管茶英;用酶聯免疫吸附試驗測定血漿組織纖溶酶原激活物[J];上海醫學檢驗雜志;2001年05期

2 楊鵬生,陳永久,董少紅,莊義浩,羅林杰,麥愛歡,陳科奇,林鐘文,吳盛標;重組組織型纖溶酶原激活劑加補救性冠狀動脈介入術與直接冠狀動脈介入術對急性心肌梗死的療效研究[J];中華心血管病雜志;2002年10期

本文編號：2894510