【摘要】：目的觀察虎杖苷(Polydatin,PD)對百草枯(Paraquat,PQ)中毒大鼠肺濕干比(Wet-to-dry weight ratio,W/D)改變,血漿和各組織PQ濃度、肺組織及血清脂質過氧化產物(Lipid peroxidation,LPO)和炎癥細胞因子水平的影響,探索其對急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)的保護作用,為臨床應用PD治療PQ中毒ALI提供理論基礎。方法(1)實驗一:建立適合本研究的急性百草枯中毒大鼠模型。取健康雌性SD大鼠32只,體重約(200±20)g,按正常生活條件適應性喂養2天后,禁食不禁水12h,同時觀察大鼠無異常情況后稱體重,并按數字隨機分組法分成4組,正常對照組、各劑量染毒組(每組8只);正常對照組生理鹽水1ml/kg灌胃,各染毒組分別以20%PQ液按質量分數低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高(75mg/kg)三種劑量進行一次性灌胃。染毒后予以普通正常喂養7天,期間不作任何處理。每天上午固定時間觀察各組大鼠的一般情況,包括有無精神反應萎靡、口鼻唇四爪發紺、呼吸困難及病理呼吸音、進食進水排泄情況的異常、攻擊性活動降低、毛色蓬松黯淡、出血及死亡或存活等綜合情況并詳細記錄,8天后將所有存活大鼠全部予以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉處死,解剖胸腔取肺組織,PBS緩沖液(pH值為7.3、0.1mol/L)反復沖冼,10%甲醛溶液固定,4℃冰箱保存待行肉眼大體病理學及病理HE染色觀察肺部情況,同時計算各染毒組大鼠的生存率,從而得出適合本研究染毒模型PQ的最佳劑量。(2)實驗二:紫外分光光度法檢測血清中百草枯方法的建立選用清潔級健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,體重約(200±20)g,將所有大鼠隨機分為正常對照組(n=5)和染毒組(n=25)。采取一次性灌胃法構建動物模型:染毒組以20%百草枯水劑按25mg/kg;對照組給予等量1mL/kg生理鹽水;給藥后每組采樣時間(于6h、12h、24h、48h、72h五個時間點,每組5只),以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉處死,分別解剖采集血清600μL與20%三氯乙酸100μL混勻以12000r/min離心10min取0.2ml的上清液,加1.8mL的蒸餾水進行紫外分光光度法(ultravioletspectrophotom-etry,Uv)測定其中百草枯的含量。本實驗采取低溫高速離心、20%三氯乙酸直接沉淀雜質蛋白分離提取中毒大鼠血漿或組織中的PQ濃度,建立Uv定量方法。用所建立的Uv檢測方法,對PQ中毒大鼠的血漿、或肺、心、肝、腎進行檢測,以為下一步實驗探討血漿或組織中的PQ濃度與中毒預后的關系奠定基礎。(3)實驗三:虎杖苷對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療作用為評價PD對PQ致大鼠急性中毒的治療作用,選用健康雌性SD大鼠80只,體重約(200±20)g,隨機分為分為3組:正常對照組(n=20)、染毒組(n=30)和PD干預組(n=30)。根據預實驗結果,染毒組和PD干預組均以20%百草枯水劑按25mg/kg一次性灌胃,建立大鼠百草枯中毒模型。PD干預組大鼠在染毒后60min給予120mg/kg虎杖苷干預藥物灌胃,染毒組及正常對照組大鼠給予等量1ml/kg生理鹽水灌胃,之后每日1次,共連續給藥3天。分別于試驗開始后6h、12h、24h、48h、72h觀察每組大鼠中毒反應,并麻醉處死(每時間點染毒組和PD干預組6只,正常對照組4只),收集血清和各組織標本-80℃冰箱保存待檢。生化法嚴格按各試劑盒說明書檢測大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)含量;酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、白介素-6(IL-6)的水平及變化規律;同時留取部分肺組織分別檢測核因子-κB(NF-κB)、羥脯氨酸(HYP)及濕/干重比值(W/D)觀察肺組織纖維化程度;紫外分光光度法(Ultravioletspectrophotometry,Uv)檢測血清和各組織中PQ水平,評估PD對各組織內PQ的清除作用。結果(1)實驗一:正常對照組全部大鼠在觀察期內無明顯變化,進食進水正常,行動反應敏捷,毛發光滑潔凈,四肢體肌力正常,體重明顯增加;經造模后,各染毒組大鼠均于2h后逐漸開始出現中毒癥狀,逐漸顯現不同程度精神呆滯、進食飲水量減少、行動反應遲緩、皮毛干澀蓬松、四肢體肌力明顯下降、呼吸急促等現象;于染毒后1~3d上述癥狀顯著加重,是大鼠死亡的高峰期;以低劑量組反應最輕,而中、高劑量組則出現不同程度口鼻唇有血性分泌物及肢體末端紫紺現象,并逐漸出現呼吸困難等缺氧表現,癥狀嚴重者死亡。從病理HE染色來看,所有染毒大鼠肺內均有肺間質增厚、炎性細胞浸潤、纖維蛋白滲出增加,大量肺泡結構萎陷破壞等病理改變,低劑量組病理變化較中、高劑量組相似,但程度較輕,均可認為達到制備急性PQ中毒大鼠模型的要求。本研究的預實驗設計的實驗周期為1周,從大鼠死亡率來看,高劑量組在7天內死亡7只,中劑量組在7天內死亡6只,而小劑量組則在7天內,死亡1只。綜合來看,符合我們進行預實驗的時間上的要求應以25mg/kg的染毒劑量進行染毒,故采用25mg/kg的染毒劑量來制備急性PQ中毒大鼠染毒模型。(2)實驗二:Uv法定量檢測染毒大鼠血清中PQ濃度線性范圍為在0.08~10μg/mL,回歸方程為y=0.0935x+0.2964,其相關系數(r)為0.9955,回收率為90.63%~103.0%,RSD為3.6%~8.12%,日內及日間RSD波動于1.1%~5.19%和2.2%~6.04%,檢測下限為0.05μg/mL。根據標準曲線回歸方程計算不同時間點血清PQ濃度,由此可見血清中PQ濃度早期至6h到達高峰之后逐漸下降,至72h仍可在血清中檢測出PQ,說明其在血清中的濃度可以有助于判斷中毒預后。在樣本處理過程中,Uv法采用三氯乙酸直接沉淀蛋白的方法處理大鼠血清樣本,可靠性較高,雜峰干擾少,具有操作簡便快捷,分析快速,結果準確。(3)實驗三:除對照組外,各組大鼠中毒癥狀相似。1.PD對實驗動物一般情況觀察結果的影響:正常對照組,全部大鼠在72h實驗期內無任何異常變化,表現良好,實驗期間體重平穩增加,染毒組大鼠出現不同程中毒癥狀,PD干預組癥狀出現相對較晚,較同時間點染毒組明顯減輕,癥狀均有不同程度改善。2.PD對實驗動物的體重變化的影響:染毒組大鼠染毒后體重則隨著染毒時間的延長呈下降趨勢,明顯低于正常對照組,PD干預組在給予藥物干預后,延緩了中毒大鼠體重下降的趨勢,與染毒組大鼠體重比較有明顯的統計學差異。3.PD對實驗動物肺濕干重比(W/D)水平的影響:在對應時間點染毒組肺W/D隨著中毒時間延長而逐漸明顯高于對照組,PD干預組與染毒組比較,各時間點W/D水平升高幅度明顯降低有統計學意義。4.PD對實驗動物血清及各組織中PQ濃度的影響:染毒后不同時間在血、肺、心、肝、腎中PQ分布及含量有明顯差異,均較正常對照組顯著升高,PD干預后各時間點均明顯低于染毒組,然后呈現出隨著時間的延長逐漸下降的趨勢,但仍然明顯高于正常對照組。5.PD對實驗動物血清中脂質過氧化反應指標物水平的的影響:染毒組和PD干預組各時間點血清MDA、MPO含量均高于正常對照組,具有顯著差異性(P0.05或P0.01),而CAT、SOD、GSH-PX含量均低于正常對照組(P0.05或P0.01);PD干預組各時間點血清MDA、MPO水平較染毒組降低,抗氧化物的酶類CAT、SOD、GSH-Px氧化還原系統水平,且隨著時間的延長而增加,逐漸較染毒組升高(P0.05或P0.01)。6.PD對實驗動物血清及肺組織中炎癥細胞因子含量的影響:與正常對照組比較,染毒組各時間點肺組織HYP、NF-κB含量呈逐漸增高趨勢(P0.05或P0.01),PD干預組與染毒組比較,肺組織HYP、NF-κB含量明顯降低,差異有統計學意義(P0.05或P0.01);與正常對照組比較,染毒組各時間點血清中TGF-β1、IL-6、TNF-α均顯著升高,差異有統計學意義(P0.05或P0.01);與染毒組比較,PD干預組血清中TGF-β1、IL-6、TNF-α含量在各時間點升高幅度明顯降低,差異均有統計學意義(P0.05或P0.01)。結論本實驗采用一次性灌胃方法成功建立了急性PQ中毒大鼠模型。鑒于紫外分光光度法的實用性、可靠性較高,可以穩定用于大鼠中毒模型的血液樣本PQ濃度的多次檢測。PQ中毒大鼠隨著時間的延長,血液PQ濃度極低或檢測不到,所以,血液PQ濃度或許不能單獨作為判斷其中毒嚴重程度以及預后的指標。PD可以明顯減輕肺干濕比、血漿和各組織PQ濃度、減輕肺組織及血清脂質過氧化物和炎癥因子在急性PQ中毒大鼠組織及血漿中的水平,來減輕PQ所致的急性肺損傷反應,可能與其有較強的抗氧化應激、抑制炎癥因子釋放等功能有密切關系,具有良好的臨床應用前景。
【圖文】：

死亡 1 只。本研究的正式實驗設計了 3d 的實驗周期，但需要所有大鼠均能存活，綜合來看，符合我們進行實驗時間上的要求應以 25mg/kg 的染毒劑量進行染毒，故采用 25mg/kg 的染毒劑量來制備急性 PQ 中毒大鼠染毒模型。3.3 實驗動物肺組織病理特點觀察3.3.1 肉眼觀察；按設計方案處死所有存活的大鼠，發現低、中、高劑量組的大鼠肺組織表面均充血腫脹，彈性差，局部有明顯的淤血，低劑量組肉眼變化與中、高劑量組相近，但程度較輕，介于二者之間；低劑量組可見雙肺均有色蒼白、質水腫、彈性差，肺表面有索條狀凹溝及突起不平的小結節，并可見小囊形成；中劑量組，大鼠肺可見水腫較明顯，肺彈性差、硬度增加，雙肺局部有明顯的大片暗紅色淤血斑；高劑量組的雙肺病變更為明顯，雙肺色褐紅，質硬，呈明顯肺實變樣改變，亦可見彌漫性出血或梗死灶，表面瘢痕牽拉周圍組織明顯，彈性及差，，雙肺布滿散在白色小結節。典型變化如圖 1：

3.3.2 光鏡觀察光鏡下觀察肺組織經石x彴袂釁

本文編號：2624419