目的:糖尿病是嚴重威脅人類健康的重大慢性疾病之一。根據最新報道,我國成年人糖尿病的患病率為10.9%,是世界上糖尿病病人最多的國家。在所有糖尿病病人中,2型糖尿病約占90-95%。盡管在過去的20年中,國內外學者對2型糖尿病進行了大量的研究工作,但其具體的病理生理機制仍不十分清楚。目前認為其發生發展因素可分為以下三類:(1)遺傳易感因素;(2)胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)所致的細胞毒性;(3)與生活和飲食方式相關的風險因素等。2型糖尿病病人以胰島β細胞功能障礙和數量顯著減少、胰島素抵抗及胰島淀粉樣蛋白沉積形成為主要病理生理學特征。其中,人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)是胰島淀粉樣蛋白沉積的主要成分。越來越多的研究表明,hIAPP誘導的胰島β細胞功能障礙和細胞凋亡增加在糖尿病的發生發展過程中具有重要作用。因此,預防和減少hIAPP沉積可減少胰島β細胞凋亡、改善胰島β細胞的胰島素分泌功能。自噬-溶酶體系統是細胞降解錯誤折疊蛋白和受損細胞器的主要途徑之一。目前研究認為自噬-溶酶體系...

【文章頁數】：113 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :短肽FLPNF增強hIAPP-INS-1 細胞自噬流的實驗研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 細胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養
            2.2.2 短肽的合成與準備
            2.2.3 Western Blot檢測TAT-FLPNF、FLPNF對 INS-1 細胞LC3 表達的影響
            2.2.4 CCK-8 檢測TAT-FLPNF對 INS-1 細胞活力的影響
            2.2.4 過表達hIAPP的 hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.6 Western Blot檢測不同濃度TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞LC3 表達的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對hIAPP-INS-1 細胞LC3、P62 表達的影響
            2.2.8 透射電子顯微鏡檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞自噬體數量的影響
            2.2.9 表達m RFP-GFP-LC3的hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.10 激光共聚焦顯微鏡檢測hIAPP-INS-1 細胞內自噬流情況
            2.2.11 統計學分析
    3 結果
        3.1 短肽TAT-FLPNF可進一步增加INS-1 細胞LC3-II/LC3-I比值
        3.2 短肽TAT-FLPNF不影響INS-1 細胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF增加細胞LC3-II/LC3-I比值的最佳濃度為200μM
        3.4 短肽TAT-FLPNF增加LC3-II/LC3-I比值可被自噬抑制劑3-MA阻斷
        3.5 短肽TAT-FLPNF顯著增加細胞自噬體數量
        3.6 短肽TAT-FLPNF促進細胞自噬體的形成
        3.7 短肽TAT-FLPNF增強細胞自噬流
    4 討論
    5 結論
第二部分 :短肽FLPNF增強hIAPP-INS-1 細胞自噬流的分子機制研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1
            2.1.1 細胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養
            2.2.2 短肽的合成與準備
            2.2.3 過表達hIAPP的 hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.4 表達myr-Akt的 HEK-293-myr-Akt細胞的構建
            2.2.5 過表達Flag-labeled mTOR的 HEK-293 細胞的構建
            2.2.6 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞p70S6K及 S6 磷酸化水平的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 HEK-293-myr-Akt細胞GSK3β及S6磷酸化水平的影響
            2.2.8 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞Akt、p70S6K及S6磷酸化水平的影響
            2.2.9 流式細胞儀檢測Anti-Flag免疫磁珠上的FITC信號強度
            2.2.10 Autodock Vina軟件預測短肽FLPNF與 FRB結構域的結合情況
            2.2.11 統計學分析
    3 結果
        3.1 短肽TAT-FLPNF抑制PI3K-Akt-mTOR-p70S6K信號通路
        3.2 短肽TAT-FLPNF抑制mTOR活性
        3.3 短肽TAT-FLPNF抑制mTORC1 活性,但不影響mTORC2 活性
        3.4 短肽FLPNF與 FRB結構域結合
    4 討論
    5 結論
第三部分 :短肽FLPNF減少hIAPP寡聚體沉積、保護hIAPP-INS-1 細胞的實驗研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1
            2.1.1 細胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養
            2.2.2 短肽的合成與準備
            2.2.3 過表達hIAPP的 hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.4 過表達r IAPP的 r IAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.5 寡聚體抗體A11 檢測短肽TAT-FLPNF對 hIAPP寡聚體沉積的影響
            2.2.6 CCK-8 檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞活力的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1細胞CleavedCaspase-3 表達的影響
            2.2.8 ELISA檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞GSIS功能的影響
            2.2.9 統計學分析
    3 結果
        3.1 短肽TAT-FLPNF減少hIAPP-INS-1 細胞內hIAPP寡聚體沉積
        3.2 短肽TAT-FLPNF提高hIAPP-INS-1 細胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF降低hIAPP-INS-1 細胞Cleaved Caspase-3 水平
        3.4 短肽TAT-FLPNF改善hIAPP-INS-1 細胞葡萄糖刺激胰島素分泌能力
    4 討論
    5 結論
本研究創新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：4004010