【摘要】：氯代乙酰胺類除草劑因分子結構中具有酰胺基團(CONH-)而得名,因其高效、高選擇性而在全球范圍內廣泛使用。乙草胺[2’-乙基-6’-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代-N-乙酰苯胺]是氯代乙酰胺類除草劑的重要代表,主要用于一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草的防除。乙草胺的主要生物降解產物為2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)和2-甲基-6-乙基苯胺(MEA),研究表明殘留在環境中的乙草胺及其降解中間產物對環境和農業生態系統都具有一定的危害。本實驗室以乙草胺為靶標,篩選到一株能將乙草胺轉化為CMEPA的菌株Rhodococcus sp. T3-1和一株能將CMEPA水解為MEA的菌株Delftia sp. T3-6.本文以Rhodococcus sp. T3-1為材料,對乙草胺N-脫乙氧甲基酶(簡稱N-脫烷基酶)基因進行克隆,以Delftia sp. T3-6為材料,對CMEPA水解酶基因進行克隆,并對重組酶的酶學性質進行了研究。快速有效的酶活測定方法是蛋白質純化的前提,本論文首先建立了一種快速測定CMEPA水解產物MEA的方法。在20 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中,10-50μM的2,6-甲乙基苯胺在鐵氰化鉀催化下與4-氨基安替比林反應生成紫紅色物質,該物質在535 nm的吸光值與MEA濃度有良好的線性關系,底物CMEPA、 SDS、甲醇等有機試劑、1 mM的金屬離子對顯色反應無顯著影響。溫度和pH對顯色反應影響顯著。該方法也適用于其它苯胺苯酚類衍生物的測定。通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Butyl-650M疏水層析和Superdex G-200凝膠層析4步純化流程,獲得達電泳純的目的蛋白(DamH).純化倍數為17.7倍,蛋白回收率為0.29%。肽指紋分析得到兩條肽段APEADDELRR和TNPLANPLKASYQGFPR, N端測序15個氨基酸序列為Gly-Thr-Ser-Pro-Gln-Ser-Asp-Phe-Leu-Arg-Ala-Leu-Phe-Gln-Ser.根據N端氨基酸序列及肽指紋圖譜設計引物,利用染色體步移技術克隆到Ilelftia sp. T3-6 CMEPA水解酶編碼基因damH,該基因全長903 bp,編碼300個氨基酸,分子量為32 kDa,與來源于Acinetobacter sp. SE19的環已醇降解基因簇的ChnC一致性為67%。構建表達菌株E. coli BL21(DE3)-(pET-29a(+)-JamH),經誘導培養后,實現重組酶DamH在E. coli BL21(DE3)中的異源表達。DamH是一個具有酯類水解活性的酰胺水解酶,在以CMEPA為底物時比活力為5036 U/mg,在以4-硝基苯酯為底物時比活力為612U/mg。DamH最適底物為CMEPA,其Km和kcat值分別為0.197 mM和2804.32 s-1。DamH具有催化芳基酰胺類化合物水解和對硝基苯酯類、三酰甘油酯和ε-已內酯水解的能力,最適酶反應pH為6.5,最適酶反應溫度為35℃。Mn2+離子對酶活有促進作用,Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe2+對酶活有抑制作用；PMSF、SDS強烈抑制酶的活性,而EDTA和DMSO對酶活影響較小。定點突變實驗結果顯示DamH活性中心可能由S149-E244-H274三聯體結構組成,除活性中心構成外,三維結構模擬結果也顯示DamH與酯酶3FAK類似,具有一個典型的Gly-X-Ser-X-Gly保守序列和S149,E244,H274三聯體催化中心以及HGX結構(79HGG81)。DamH在蛋白濃度為15 mg/mL,結晶池母液為：0.2 M乙酸銨,pH7.1,21%PEG 3350,坐滴氣相擴散法20℃下約18天能長出衍射能力達3.4 A的晶體。乙草胺的降解首先要進行N-脫乙氧甲基,生成CMEPA進而被DamH水解為MEA。該過程由乙草胺N-脫烷基酶催化完成,乙草胺N-脫烷基酶性質非常不穩定,普通的超聲波破碎法會導致酶快速失活。本論文首先研究了細胞破碎提取乙草胺N-脫烷基酶粗酶液的方法和測活體系,建立了以液氮研磨方法制備Rhodococcus sp. T3-1粗酶液的方法,在含1 mM NADH+H+,40%蔗糖,0.1 M NaCl,10mM MgCl2,2mMβ-巰基乙醇的20 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中,利用粗酶液和DamH兩步催化形成MEA,利用顯色法可間接檢測到乙草胺N-脫烷基酶活性。通過硫酸銨分級沉淀、疏水層析從Rhodococcus sp. T3-1粗酶液中分離到三個蛋白,肽指紋圖譜結果顯示三個蛋白分別為鐵氧化還原酶EthA (45 kDa)、鐵氧還蛋白EthD(11kDa)和細胞色素P450單加氧酶EthB (43 kDa)。基于氨基酸序列分析和核酸序列分析,設計引物擴增ethABCD基因簇,分別構建不同基因組織形式的表達菌株,以誘導表達菌株全細胞進行催化實驗證實了參與乙草胺N-脫乙氧甲基反應的三個蛋白為EthA-EthD-EthB。
【圖文】：

２．２．２芳基憸胺酶和憸胺酶的特征逡逑蛋白質晶體學的發展使從原子水平上認識酶的反應機制成為可能，Ａｋａｓｈｉ邋Ｏｈ化ｋｉ逡逑等解析了來源于巧々0加ｃｏｃｃｗ邋ｓｐ．邋Ｎ－７７１的ＲｈＡｍｉｄａｓｅ邋（ＰＤＢ：邋３Ａ１Ｋ）的結構（圖１－９）。逡逑ＲｈＡｍｉｄａｓｅ能水解己憸胺、丙憸胺、苯甲櫼胺，其活性中也由Ｓｅｒｌ７１，Ｓｅｒｌ９５和Ｌｙｓ９６逡逑Ｈ個氨基酸殘基組成（圖１－１０），其中Ｓｅｒｌ７１位于一段憸胺酶家族高度保守的序列逡逑（Ｇ１６９－Ｇ１７０－Ｓ１７１－Ｓ１７２－Ｇ１７３－Ｇ１７４）之中［９５］。逡逑圖１－９邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ結構示意圖逡逑巧ｇ．邋１－９邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑ＰｈｅｌｉＳｓ／逡逑^6逡逑＾邐Ｓｅｒ１７１逡逑Ａｌａ１９５邋巧邋ｅｒ１９邋巧、邐、逡逑Ｌｙｓ９６邋／逡逑圖１－１０邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ的活性中屯及與底物結合方式逡逑Ｆｉｇ．邋１－１０邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉ化邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑１２逡逑

２．２．２芳基憸胺酶和憸胺酶的特征逡逑蛋白質晶體學的發展使從原子水平上認識酶的反應機制成為可能，Ａｋａｓｈｉ邋Ｏｈ化ｋｉ逡逑等解析了來源于巧々0加ｃｏｃｃｗ邋ｓｐ．邋Ｎ－７７１的ＲｈＡｍｉｄａｓｅ邋（ＰＤＢ：邋３Ａ１Ｋ）的結構（圖１－９）。逡逑ＲｈＡｍｉｄａｓｅ能水解己憸胺、丙憸胺、苯甲櫼胺，其活性中也由Ｓｅｒｌ７１，Ｓｅｒｌ９５和Ｌｙｓ９６逡逑Ｈ個氨基酸殘基組成（圖１－１０），其中Ｓｅｒｌ７１位于一段憸胺酶家族高度保守的序列逡逑（Ｇ１６９－Ｇ１７０－Ｓ１７１－Ｓ１７２－Ｇ１７３－Ｇ１７４）之中［９５］。逡逑圖１－９邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ結構示意圖逡逑巧ｇ．邋１－９邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑ＰｈｅｌｉＳｓ／逡逑^6逡逑＾邐Ｓｅｒ１７１逡逑Ａｌａ１９５邋巧邋ｅｒ１９邋巧、邐、逡逑Ｌｙｓ９６邋／逡逑圖１－１０邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ的活性中屯及與底物結合方式逡逑Ｆｉｇ．邋１－１０邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉ化邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑１２逡逑
【學位授予單位】：南京農業大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X592;X172

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