一.研究目的：研究Smad相互作用蛋白-1（Sipl/Zfhx1b）對少突膠質細胞分化成熟的調節作用,以及發現Sip1的直接作用的下游基因,并探索Sip1/Zfhx1b促進少突膠質細胞分化成熟和啟動髓鞘生成作用的分子機制。二.研究方法：1.Sip1/Zfhx1b在少突膠質細胞分化成熟中的作用：（1）免疫染色法測定Sip1在中樞神經系統內少突膠質細胞豐富區域的表達情況；（2）原位雜交技術確定Sip1在脊髓中的發育情況；（3）建立少突膠質細胞內Sip1特異性敲除模型,評價Sip1敲除后小鼠的小鼠表型和生存的影響；（4）Sip1敲除小鼠模型中,免疫染色法和原位雜交技術評價與少突膠質細胞分化成熟的相關標記物的變化情況；（5）電鏡下觀察Sip1敲除小鼠的髓鞘生成的變化情況；（6）免疫染色法評價體外敲除Sip1基因對少突膠質細胞的影響；（7）Sip1敲除小鼠模型中,原位雜交技術確定OPC的增殖能力的改變情況。2. Sipl/Zfhx1b調控少突膠質細胞分化成熟和啟動髓鞘生成作用的分子機制研究：2.1 Sipl/Zfhx1b調控少突膠質細胞分化成熟相關通路的分子機制研究（1）熒光素酶報告基因法確定S... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
目次
前言
第一部分 Sip1基因條件下敲除后的表型研究
    1.1 實驗儀器與材料
        1.1.1 儀器
        1.1.2 藥物與試劑
        1.1.3 細胞株和OPC原代培養
        1.1.4 實驗動物
    1.2 實驗方法
        1.2.1 Sip1條件性敲除小鼠和Olig1突變型小鼠模型構建
        1.2.2 質粒構建
            1.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1構建
            1.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,lenti-GFP-mSip1,lenti-GFP—Flag-Smurf1構建
        1.2.3 OPC的純化和分化
        1.2.4 組織學和原位雜交
        1.2.5 組織和細胞免疫熒光和confocal顯微鏡
        1.2.6 病毒制備
            1.2.6.1 腺病毒制備
            1.2.6.2 慢病毒制備
    1.3 實驗結果
        1.3.1 Sip1/Zfhx1b在Olig1突變小鼠中顯著下降
        1.3.2 Sip1表達在腦組織和脊髓少突膠質細胞豐富的區域
        1.3.3 Sip1在脊髓腹側的發育情況
        1.3.4 Sip1敲除引起動物的死亡
        1.3.5 Sip1敲除能抑制髓鞘基因生成和軸突髓鞘化
        1.3.6 OPC生成和增殖不受Sip1敲除的影響
        1.3.7 體外敲除Sip1抑制OPC的分化
第二部分Sip1調控少突膠質細胞分化和啟動軸突髓鞘化的作用機制研究
    2.1 實驗儀器與材料
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 藥物與試劑
        2.1.3 細胞株和OPC原代培養
        2.1.4 實驗動物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 Sip1條件性敲除小鼠模型構建
        2.2.2 質粒構建
            2.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1構建
            2.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,GFP-mSip1,GFP—Flag-Smurf1構建
        2.2.3 細胞培養
        2.2.4 OPC的純化和分化
        2.2.5 組織學和原位雜交
        2.2.6 組織和細胞免疫熒光和confocal顯微鏡
        2.2.7 western blotting和免疫共沉淀
            2.2.7.1 western blotting
            2.2.7.2 免疫共沉淀
        2.2.8 病毒制備
            2.2.8.1 腺病毒制備
            2.2.8.2 慢病毒制備
        2.2.9 熒光素酶報告基因法
        2.2.10 染色質免疫共沉淀
    2.3 實驗結果
        2.3.1 Sip1拮抗Smad/BMP信號通路在少突膠質細胞分化過程中的抑制性作用
            2.3.1.1 Sip1拮抗磷酸化Smad1在少突膠質細胞分化過程中的抑制性作用
            2.3.1.2 Sip1拮抗Id2、4和Hes1的激活
            2.3.1.3 Sip1的敲除不改變pSmad1的表達
            2.3.1.4 OLs階段pSmad1連接Sip1和p300形成復合物
        2.3.2 Sip1通過影響不同的少突膠質細胞分化的調節因子促進OPC的分化
        2.3.3 Sip1調控的髓鞘基因和BMP等相關通路
        2.3.4 Sip1調節少突膠質細胞分化相關因子的啟動子區域
        2.3.5 Smad7是少突膠質細胞內Sip1的下游基因
            2.3.5.1 Smad7表達在野生型小鼠脊髓腹側部的少突膠質細胞內
            2.3.5.2 Sip1和Smad7在OLs內表達明顯增多
            2.3.5.3 Sip1直接調控Smad7的表達
            2.3.5.4 Smad7過表達拮抗Sip1基因缺失引起的OPC分化障礙
        2.3.6 Smad7協同Smurf1調控BMP和Wnt信號通路
        2.3.7 Smad7促進少突膠質細胞相關標記物的異位表達
        2.3.8 Smad7敲除能抑制髓鞘基因生成
3 討論
參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡介及在讀期間所取得的科研成果



本文編號：2897428