目的利用大腸桿菌高效表達并純化E型肉毒神經毒素（BoNT/E）受體結合區Hc的亞結構域EHc-C蛋白,并進行免疫原性研究。方法利用PCR技術擴增出EHc-C基因,克隆于載體pTIG-Trx-His-tag中得到重組質粒pTIG-Trx-EHc-C,轉入表達菌株BL21（DE3）,經IPTG誘導表達后,超聲破碎菌體,收集上清,經鎳柱親和純化獲得重組抗原EHc-C蛋白,通過SDS-PAGE和Western印跡檢測純化效果,之后免疫BALB/c小鼠,評價其免疫原性。結果通過原核表達純化獲得了純度>90%的重組抗原EHc-C蛋白,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠產生了特異性抗體反應,10μg劑量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104LD50E型肉毒毒素攻擊,血清中和抗體效價可達1.00 U/ml。結論獲得的重組EHc-C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻擊,產生強烈保護作用,可作為亞單位候選疫苗預防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗體的功能表位。 

【文章來源】：軍事醫學. 2019年05期 第346-351頁 北大核心

【文章頁數】：6 頁

【部分圖文】：

pTIG-Trx-EHc-C菌落PCR鑒定圖

軍事醫學2019年5月第43卷第5期MilMedSci，Vol43，No5，May，2019柱對重組EHcC蛋白進行純化，經SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小，且咪唑濃度為100mmol/L時純度達到了電泳級。Western印跡證實該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結合，具有E型毒素的抗原性（圖3）。圖2EHc-C誘導表達的SDS-PAGE檢測M.蛋白質相對分子質量標志物；1.未加IPTG誘導對照；2.包涵體；3.誘導表達破菌上清；4.誘導表達全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質相對分子質量標志物；1.誘導表達破菌上清；2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白；3.穿過液；4.脫鹽蛋白；5，6.Western印跡檢測表達純化產物：5.一抗為抗EHc抗體；6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應，第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強，陰性對照組的抗體水平無變化（圖4），表明此重組抗原免疫原性良好；抗體滴度的結果表明，EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200，最高滴度為1∶6400；第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200，最高滴度為1∶409600（圖5），相對于第2次免疫的抗體滴度，第3次有明顯的增強，該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產生了特異性抗體反應；此外，還對免疫后小鼠產生的抗體亞型進行了測定，抗原EHcC免疫小鼠后產生的特異性抗體主要為IgG1（圖6），即提示此抗原免疫小鼠后產生的抗體反應更傾向于Th2

?2019年5月第43卷第5期MilMedSci，Vol43，No5，May，2019柱對重組EHcC蛋白進行純化，經SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小，且咪唑濃度為100mmol/L時純度達到了電泳級。Western印跡證實該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結合，具有E型毒素的抗原性（圖3）。圖2EHc-C誘導表達的SDS-PAGE檢測M.蛋白質相對分子質量標志物；1.未加IPTG誘導對照；2.包涵體；3.誘導表達破菌上清；4.誘導表達全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質相對分子質量標志物；1.誘導表達破菌上清；2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白；3.穿過液；4.脫鹽蛋白；5，6.Western印跡檢測表達純化產物：5.一抗為抗EHc抗體；6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應，第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強，陰性對照組的抗體水平無變化（圖4），表明此重組抗原免疫原性良好；抗體滴度的結果表明，EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200，最高滴度為1∶6400；第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200，最高滴度為1∶409600（圖5），相對于第2次免疫的抗體滴度，第3次有明顯的增強，該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產生了特異性抗體反應；此外，還對免疫后小鼠產生的抗體亞型進行了測定，抗原EHcC免疫小鼠后產生的特異性抗體主要為IgG1（圖6），即提示此抗原免疫小鼠后產生的抗體反應更傾向于Th2型免?


本文編號：2907750