【摘要】：目的:研究葛根素對MC3T3-E1成骨細胞發育的影響及機制,為臨床治療骨質疏松癥及葛根素的開發利用提供一定的理論指導。方法:1.細胞活性測定:不同濃度的(0.1,1,l0μM)葛根素培養成骨細胞24,48和72h后,CCK-8法檢測空白對照組和葛根素組的細胞活性。2.細胞分化水平測定:lμM葛根素作用于成骨細胞72h后測定細胞堿性磷酸酶(ALP)活性。3.細胞礦化水平測定:lμM葛根素處理成骨細胞7、14和21d后,茜素紅鈣結節染色法測定細胞礦化結節面積。4.蛋白表達水平測定:1μM葛根素作用細胞0,48,72h后以及100μM RAP(自噬激動劑)和75μM 3-MA(自噬抑制劑)作用細胞72h后,Western Blotting法測定Beclin1和LC3B蛋白質的表達水平。5.細胞超微結構觀察:1μM葛根素和100μM 3-MA作用成骨細胞72h后電鏡下觀察細胞超微結構并拍攝圖片。6.自噬對成骨細胞的影響:使用100μM 3-MA作用MC3T3-E1細胞后,檢測成骨細胞增殖、分化和礦化能力的改變。7.葛根素對miR-204表達水平的影響:RT-qPCR法檢測葛根素作用后miR-204表達水平。8.miR-204的作用靶點預測:采用TargetScan靶點預測軟件分析miR-204與小鼠LC3B基因可能的結合位點。9.miR-204對成骨細胞自噬水平和超微結構的影響:成骨細胞轉染miR-204-siRNA后,檢測LC3B蛋白質的表達水平并于電鏡下觀察細胞超微結構。結果:1.葛根素(0.1,1,10μM)可顯著促進小鼠MC3T3-E1成骨細胞的增殖,1μμM葛根素為最佳濃度。與空白對照組相比,1μM的葛根素作用72h可明顯提高ALP活性,并促進礦化結節的形成。2.1μM濃度葛根素作用于細胞后,與空白對照組比較自噬標志物Be clinl和LC3B的蛋白質表達水平明顯升高,其中72h作用效果最好,且作用72h后葛根素組LC3B的蛋白表達水平略高于自噬激動劑組。此外,葛根素組細胞電鏡下可明顯觀察到自噬特有的雙層膜結構。3.自噬抑制劑(3-MA)作用細胞72h后,明顯抑制成骨細胞增殖和分化,而對礦化結節形成影響不顯著。4.1μM葛根素作用細胞72h后,miR-204表達水平顯著下調。5.生物信息學分析表明,LC3B mRNA中的miR-204結合位點是位于LC3B 3'UTR的44和50bp之間的廣泛保守的元件。6.轉染miR-204-siRNA作用細胞后,與空白對照組比較,LC3B的蛋白質表達水平明顯上升,并且電鏡下細胞出現自噬特有的雙層膜結構。結論:(1)葛根素可以促進成骨細胞增殖、分化和礦化。(2)葛根素作用于成骨細胞可以產生自噬現象。(3)葛根素作用成骨細胞產生的自噬可以促進成骨細胞增殖和分化,對礦化影響不明顯。(4)下調miR-204表達導致LC3B表達增強可能是葛根素促成骨細胞自噬的分子機制。
【圖文】：

實驗研究逡逑結果逡逑對ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞增殖能力的影響逡逑１可見，不同濃度的葛根素（０．１，邋１，邋ｌＯ＾Ｍ）分別處理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞－８檢測結果顯示，與空白對照組相比，（除０．１和ｌＯ＾Ｍ葛根素作用２４根素作用細胞后，ＯＤ值均顯著增高。而ｌｐＭ葛根素作用７２ｈ促增殖ＡＬＰ堿性磷酸酶活性的檢測實驗中將葛根素藥物濃度確定為ｌｕＭ，

３．葛根素對ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞形成礦化結節能力的影響逡逑通過茜素紅染色法計算礦化結節面枳，進一步檢測葛根素對Ｎ１Ｃ３Ｔ３－Ｅ１細胞礦化的影逡逑響。如圖３Ａ－Ｂ所示，與對照組相比，用小Ｍ濃度葛根素分別處理細胞７，邋１４和２１ｄ／Ｔｆ，逡逑礦化結節的形成顯著增加。結果表明，葛根素能提高ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞的礦化能力，，促進Ｍ逡逑Ｃ３Ｔ３－Ｅ１細胞的進？？步分化成熟。逡逑灥v醻枺停歟殄澹輳輳剩潁椋潁戾義希悖錚睿簦潁錚戾澹ǎ保埃埃╁澹穡酰邋澹ǎ

本文編號：2629113