【摘要】：尿酸代謝異常泛指血液中尿酸水平過高,進(jìn)而在體內(nèi)沉積并最終引發(fā)痛風(fēng)的病癥。其典型代表高尿酸血癥(HUA)已發(fā)展成為繼“高血糖、高血壓、高血脂”三高外的“第四高”,在我國呈現(xiàn)“高流行、年輕化”的趨勢。尿酸屬于人體嘌呤代謝通路的終末產(chǎn)物,其產(chǎn)生過程中受通路上多種生物活性酶的調(diào)控。而當(dāng)人群頻繁和大量攝入高嘌呤含量食品時,則會導(dǎo)致大量尿酸生成,超出人體自身代謝能力,引發(fā)尿酸代謝異常疾病。目前臨床上尚無可以根治尿酸代謝異常疾病的有效手段,包括黃嘌呤氧化酶(XO)抑制劑別嘌呤醇等在內(nèi)的藥物不僅需要長期服用,而且都具有較強(qiáng)的毒副作用,給患者帶來較大負(fù)擔(dān)。因此,具有高效低毒特點的天然活性成分,尤其是特殊結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物,在營養(yǎng)干預(yù)尿酸代謝異常方面有著巨大的潛在市場,也是近些年的熱點研究課題。本文旨在探究紫薯花色苷干預(yù)尿酸代謝異常的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。利用酸醇浸提法、乙酸乙酯萃取法及AB-8大孔吸附樹脂制備紫薯花色苷一次純化物(APSPE),與9種商業(yè)不同來源花色苷富集物,比較其對XO抑制活性強(qiáng)弱;進(jìn)一步利用ODS反向制備填裝柱制備不同的紫薯花色苷二次純化級分,利用高效液相色譜(HPLC)對花色苷成分進(jìn)行定性定量分析,并基于體外XO抑制實驗篩選得到酶活抑制效果最佳的二次純化級分;在此基礎(chǔ)上,利用熒光光譜分析法進(jìn)一步比較花色苷純化級分與XO相互作用,對活性最佳的紫薯雙酰基花色苷純化級分(HAA-PSP),采用熒光猝滅光譜法和圓二色譜法系統(tǒng)研究其與XO間的相互作用機(jī)制;利用計算機(jī)模擬分子對接手段研究紫薯含有的典型分子結(jié)構(gòu)的單體花色苷與XO相互作用的模式,從理論角度深入探究紫薯花色苷分子與XO活性位點相互作用的結(jié)合模式,并揭示其抑制XO活性的關(guān)鍵基團(tuán);利用HUA小鼠模型,系統(tǒng)評價HAA-PSP體內(nèi)降尿酸的生物活性,通過研究其對尿酸生成通路關(guān)鍵酶的調(diào)控作用,以期揭示紫薯花色苷干預(yù)尿酸代謝異常的分子機(jī)制;最后,將HAA-PSP與別嘌呤醇按一定濃度進(jìn)行復(fù)配,研究別嘌呤醇和HAA-PSP改善HUA小鼠尿酸水平、腎臟損傷、氧化應(yīng)激等生理作用的單獨和聯(lián)合效應(yīng)及機(jī)制,探討HAA-PSP是否能在保證降尿酸治療效果的前提下,通過減少別嘌呤醇的使用劑量,進(jìn)而緩解高尿酸血癥患者的腎臟炎癥及功能性損傷。主要研究結(jié)論如下:(1)采用酸醇浸提法及乙酸乙酯萃取法制備紫薯花色苷粗提物,利用AB-8大孔吸附樹脂制備得到紫薯花色苷一次純化物APSPE;在XO活性抑制方面,與市面上的商業(yè)不同來源的花色苷富集物相比,APSPE具有明顯優(yōu)勢,表現(xiàn)出更為顯著的“劑量-效應(yīng)關(guān)系”。APSPE經(jīng)過ODS純化獲得4個紫薯花色苷純化級分,pH示差法及HPLC結(jié)果顯示,級分1主要組分為花色苷輔色素,級分2為分子量900左右的單酰基花色苷,級分3為分子量1100左右的雙酰基花色苷,級分4的花色苷含量極低,推測主要為其它雜質(zhì)成分。活性比較結(jié)果顯示級分3對XO活性抑制作用最強(qiáng),級分2效果次之。此部分研究結(jié)果表明紫薯花色苷中起主要XO抑制效果的是花色苷組分而非輔色素,且紫薯雙酰基花色苷(大分子量)的抑制作用要明顯強(qiáng)于單酰基花色苷(小分子量)。(2)利用紫薯花色苷二次純化級分1、2、3開展熒光猝滅光譜和圓二色譜分析可知,隨著花色苷含量的增加,XO固有熒光強(qiáng)度不斷降低,說明花色苷純化級分與XO間存在相互作用。其中級分3,即雙酰基花色苷級分(HAA-PSP)對XO的熒光猝滅效果最好。進(jìn)一步分析相關(guān)數(shù)據(jù)可知,HAA-PSP對XO的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅作用,且與XO活性空腔上僅存在單一結(jié)合位點。二者的相互作用過程中的主要作用力為疏水相互作用,結(jié)合過程可能屬于熵驅(qū)動的吸熱自發(fā)反應(yīng)。由圓二色譜實驗結(jié)果可知,隨著HAA-PSP與XO摩爾比的增加,XO圓二色譜特征峰的橢圓率逐漸降低,表明HAA-PSP能夠?qū)O的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響;其與XO的結(jié)合能夠使酶的構(gòu)象發(fā)生重排,對其氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,并導(dǎo)致XO的二級結(jié)構(gòu)變得更加致密,限制底物與XO的結(jié)合過程,最終導(dǎo)致XO的催化活性降低,對酶活產(chǎn)生了抑制效果。(3)計算機(jī)模擬分子對接結(jié)果顯示,雙酰基花色苷結(jié)構(gòu)與XO的結(jié)合程度高于單酰基花色苷結(jié)構(gòu)及不含酰基基團(tuán)的花色苷結(jié)構(gòu),酰基基團(tuán)在大分子量花色苷與XO活性中心的識別與結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用。其中,紫薯花色苷結(jié)構(gòu)中槐糖苷所攜帶的酰基基團(tuán)能夠有效深入XO活性空腔內(nèi)部,并與Lys771、Glu802、Glu879、Arg880、Val1011、Pro1012等周圍的活性氨基酸殘基形成相互作用,除酰基基團(tuán)外的花色苷其它結(jié)構(gòu)則能夠與XO活性通道口附近氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用并覆蓋活性通道口的位置,從兩方面同時對底物進(jìn)入活性空腔與鉬喋呤結(jié)合的過程產(chǎn)生一定的阻礙作用。紫薯芳香族雙酰基花色苷與XO相互作用的驅(qū)動力主要為疏水相互作用,同時存在氫鍵等輔助作用力。此外,酰基基團(tuán)類型差異對其與XO相互作用所產(chǎn)生的酶活抑制效應(yīng)有一定的干預(yù)和影響,與矢車菊素為母核結(jié)構(gòu)的花色苷分子相比,以芍藥素為母核結(jié)構(gòu)的花色苷分子受酰基基團(tuán)類型的影響和干擾更大。除此之外,咖啡酰相較于阿魏酰等其它基團(tuán),屬于更優(yōu)勢基團(tuán),對花色苷與XO酶的結(jié)合起到協(xié)助作用。(4)HUA小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明,HAA-PSP能夠有效調(diào)控HUA小鼠血清尿酸水平,且作用效果明顯強(qiáng)于APSPE。在給藥期間,HAA-PSP未對小鼠臟器產(chǎn)生明顯毒性損傷,且能夠顯著調(diào)節(jié)HUA小鼠血清尿素氮和肌酐水平,削弱HUA小鼠的腎臟損傷。與此同時,HAA-PSP又能有效抑制尿酸生成通路關(guān)鍵酶,如黃嘌呤氧化酶(XO)、腺苷脫氨酶(ADA)及5’-核苷酸酶(5’-NT)的活性,能夠從源頭抑制高尿酸血癥小鼠體內(nèi)尿酸及其前體物的生成,達(dá)到降低尿酸水平的效果。(5)將HAA-PSP與別嘌呤醇按一定濃度進(jìn)行復(fù)配再次開展HUA小鼠體內(nèi)動物實驗,結(jié)果顯示,當(dāng)HAA-PSP與別嘌呤醇復(fù)配共同使用時,其對于HUA小鼠的降尿酸活性與HAA-PSP單獨使用相比更顯著,推測HAA-PSP可能對別嘌呤醇間存在一定的輔助效應(yīng),即能在減少別嘌呤醇的攝入量的同時維持一定的降尿酸活性,達(dá)到改善和調(diào)節(jié)尿酸代謝異常的作用效果。而HAA-PSP與低劑量別嘌呤醇復(fù)配使用能夠有效緩解HUA小鼠由于高劑量別嘌呤醇使用所造成的腎臟功能性損傷,即表現(xiàn)為小鼠血清尿素氮和肌酐水平的調(diào)控及腎臟組織病理學(xué)切片觀察到的炎性細(xì)胞浸潤程度的減輕、腎小球及近曲小管的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)恢復(fù)到正常化趨勢、腎小球基底膜和系膜基質(zhì)的增生情況得到抑制等現(xiàn)象。此外,HAA-PSP與低劑量別嘌呤醇的聯(lián)合使用能夠有效增強(qiáng)高尿酸血癥小鼠體內(nèi)氧化防御能力,從而緩解由HUA引發(fā)的體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷癥狀;同時,HAA-PSP與低劑量別嘌呤醇的聯(lián)合使用能夠顯著阻礙NF-κB通路的活化過程,減少和抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1、白細(xì)胞介素家族中的IL-6與IL-1β、黏附分子ICAM-1、環(huán)氧合酶COX-2在腎臟中的釋放情況,從而減輕高尿酸血癥小鼠的腎臟炎癥,并有效降低高劑量別嘌呤醇產(chǎn)生的機(jī)體不良反應(yīng)。由此可以推斷,HAA-PSP作為天然膳食功能因子,能夠在與別嘌呤醇的輔助治療中有效降低別嘌呤醇的使用劑量,同時緩解藥物對患者腎臟產(chǎn)生的額外損傷,從而延緩高尿酸血癥患者在治療過程中引發(fā)的慢性腎病的發(fā)生與發(fā)展。本課題的研究成果期望為膳食花色苷營養(yǎng)干預(yù)高尿酸血癥、防治尿酸代謝異常提供科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 人體嘌呤合成與代謝通路示意圖Fig. 1-1 The purine synthetic and metabolic pathway in human body嘌呤的降解過程主要從脫去氨基開始。在腺苷脫氨酶（ADA）的催化下苷脫去氨基生成次黃嘌呤核苷。鳥嘌呤在鳥嘌呤脫氨酶（GDA）的催化下生成次黃嘌呤。隨后，次黃嘌呤和黃嘌呤在 XO 的作用下被氧化生成尿酸（B al 2011）。當(dāng)人們長期攝入大量富含腺嘌呤和次黃嘌呤的食物時，會促進(jìn) ADDA 等脫氨酶及 XO 的活性，產(chǎn)生大量尿酸，導(dǎo)致血清濃度增加。由圖 1-，5’-核苷酸酶（5’-NT）主要催化嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)化為對應(yīng)嘌呤核苷（王雪16），ADA 主要介導(dǎo)腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化生成次黃嘌呤核苷的脫氨基過程（安海 2016），二者均能導(dǎo)致過量尿酸前體物質(zhì)的生成，而 XO 則主要介導(dǎo)最后尿生成過程，，最終導(dǎo)致尿酸水平的升高。因此，針對以上生物酶的抑制和調(diào)控為拮抗尿酸代謝異常研究的重要內(nèi)容。通過抑制生物酶的活性，能夠?qū)φ麄�合成通路產(chǎn)生調(diào)控作用，進(jìn)而減少尿酸前體物的生成，間接調(diào)控血清尿酸水

圖 1-2 人體腎臟尿酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體Fig. 1-2 Uric acid-related transporters in human kidney謝異常臨床治療手段風(fēng)急性治療的藥物上秋水仙堿、非甾體抗炎藥和甾體類糖皮質(zhì)激素等藥風(fēng)的發(fā)作頻率，緩解痛風(fēng)發(fā)作急性期的癥狀。其中，臨床治療急性痛風(fēng)和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常用及優(yōu)選藥物可以抑制由急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)局部白細(xì)胞關(guān)節(jié)處的尿酸鹽晶體的吞噬，減少乳酸、溶酶體等的的附著，從而消除關(guān)節(jié)炎癥及腫脹、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)尿酸血癥治療的藥物機(jī)制，目前高尿酸血癥臨床治療藥物主要包括促尿酸
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589.7;TS264.4


本文編號：2629145