【摘要】：隨著對腸道菌群領域的深入研究,許多證據表明,腸道菌群與宿主的肥胖、高血壓、糖尿病等慢性病高度相關,人們正在從以前被忽視了的腸道菌群角度研究這些慢性病的起源、發展與防控策略,有望為慢性病防控帶來新思路。在國內外這些研究以及自身驗證的基礎上,我們實驗室于2013年提出“饑餓源于菌群”的科學假說,并通過大量研究形成“柔性辟谷”技術,通過連續7-14日服用復合益生元減少和消除人體饑餓感,讓人體進入到模擬禁食狀態,有助于人體將腸道菌群恢復正常狀態,為從源頭上改善慢性病提供了參考思路。自該技術提出以來,已陸續與多家醫院合作完成相關臨床研究,在生理性減重及改善多種慢性病上獲得良好效果。為進一步研究柔性辟谷技術對肥胖人群高血糖等慢性病指標改善的效果,本文首先通過與太原市第二人民醫院營養科展開合作,招募志愿者體驗為期一周的柔性辟谷技術改善肥胖人群高血糖等慢性病問題的研究,并在干預開始前后檢測并記錄志愿者的相關生理生化指標,利用統計學軟件SPSS 16.0進行數據統計分析,利用GraphPad Prism 6.0進行繪圖。結果表明,柔性辟谷一周后與干預前相比,志愿者的體重、BMI、內臟脂肪量及體脂肪顯著下降(P0.01),舒張壓(P=0.003)、收縮壓(P=0.045)、空腹血糖(P=0.001)、空腹胰島素水平(P=0.000)也均顯著下降,而腎功、肝功及電解質等指標均在正常值范圍內略有波動,說明柔性辟谷技術不僅能對高血糖等慢性病的不良指標有改善作用,而且具有良好的安全性。根據此次柔性辟谷對空腹血糖和空腹胰島素這兩個血糖代謝指標的改善作用,結合實驗室以往有關柔性辟谷的研究結果(改善志愿者的腸道微生態,特異性增長有益菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌),推測血糖代謝指標的改善與腸道微生態的改善有關。為進一步研究其中的相關性,我們設計利用復合抗生素建立小鼠腸道微生態紊亂模型,從而觀察腸道微生態對小鼠血糖代謝調控的影響。在此假設的基礎上,首先,我們選取C57、BALB/c、CD1和KM四種常見品系小鼠進行口服葡萄糖耐受量測試(OGTT)(15%葡萄糖溶液,0.2mL每只小鼠),并利用Origin 8.0軟件對小鼠不同時間點(0,5,10,15,30,60,120 min)的血糖值進行曲線擬合。研究結果發現,小鼠的糖代謝曲線均在15min左右達到頂峰,在120min左右恢復正常,且均符合Giddings數學模型(R~2≥0.95)即y=y0+_W~A√_X~(Xc)I1(_W~(2√XcX)e_W~(-X-Xc)),說明選取的4種品系小鼠對口服葡萄糖耐受有較好的一致性。隨后,我們選取在上述口服葡萄糖耐量實驗中對糖水高敏感度的C57小鼠為對象進行深入研究。具體過程為,將90只18-22g的雄性C57小鼠隨機分為6組,分別是“生理鹽水+普通飼料組”、“抗生素+普通飼料組”、“生理鹽水+高脂飼料組”、“抗生素+高脂飼料組”、“生理鹽水+高葡萄糖飼料組”和“抗生素+高葡萄糖飼料組”。所有小鼠在實驗開始前在普通實驗環境下預先飼養一周(正常飲食、飲水)以便適應環境,隨后按照設計好的分組方式進行復合抗生素(參考文獻報道選用青霉素、萬古霉素、甲硝唑、新霉素)和不同飼料持續干預4周。采用常規方法測小鼠體重、血糖;采用酶聯免疫法測小鼠血清胰島素、組胺、腎上腺素水平;口服葡萄糖耐受量測試測小鼠糖耐量后利用Origin 8.0軟件進行曲線擬合,分析動物血糖變化特征。結果顯示,在復合抗生素干預下,小鼠血糖水平顯著降低(P=0.000),同時導致小鼠葡萄糖耐受量變化趨勢有所偏離Giddings曲線(R~20.95),但不同飼料(普通飼料、高脂飼料和高葡萄糖飼料)干預對小鼠血糖水平和葡萄糖耐受量曲線無明顯影響。多因素方差分析結果顯示,在小鼠體重、胰島素、組胺水平上,抗生素與飼料干預無交互作用,抗生素與生理鹽水組間無統計學差異,不同飼料分組之間有統計學差異。與普通飼料組相比,高脂飼料組的血清胰島素水平、血清組胺水平顯著降低(P=0.000,P=0.033),體重無統計學差異。與普通飼料組相比,高葡萄糖飼料組體重顯著降低(P=0.012),血清組胺水平顯著升高(P=0.002),血清胰島素水平無統計學差異。與高脂飼料組相比,高葡萄糖飼料組體重顯著降低(P=0.000),血清胰島素水平、血清組胺水平顯著升高(P=0.000,P=0.000)。抗生素與飼料干預在腎上腺素水平上具有交互作用(P0.05),不同飼料組間抗生素組與生理鹽水組的腎上腺素水平均有統計學差異,其中普通飼料組與高葡萄糖飼料組內抗生素干預引起腎上腺素水平顯著降低(P=0.008,P=0.013),而高脂飼料組內抗生素干預引起腎上腺素水平顯著上升(P=0.007)。為了研究腸道菌群在抗生素導致小鼠血糖代謝前后改變情況,我們利用16S rRNA測序技術對各組小鼠糞便樣本進行分析,并通過對譯出信息剪切過濾,分別進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,物種注釋以及豐度分析,反映各組小鼠腸道菌群的分布特征變化。從稀釋曲線(Rarefaction Curve)及等級聚類曲線(Rank Abundance)的分析結果可見,抗生素處理組的菌群豐富度比生理鹽水組顯著降低。可觀測物種數(Observed Species)和Shannon指數結果顯示,抗生素組內物種多樣性和菌群豐富度顯著低于對應的生理鹽水組。主坐標分析(PCoA)及主成分分析(PCA)結果顯示,抗生素組與生理鹽水組之間存在顯著的腸道菌群聚類差異。采用t-檢驗以及MetaStat法進行統計分析結果顯示,在門水平上,使用抗生素可導致含致病菌和機會致病菌的變形菌門的相對豐度顯著升高(P0.01),并導致厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門等正常腸道菌群內優勢菌門相對豐度的顯著降低(P0.01)。在屬水平上,“抗生素+普通飼料組”對比“生理鹽水+普通飼料組”結果顯示,除乳桿菌屬(Lactobacillus)和Roseburia外,其余菌屬間均具有統計學差異(P0.01),其中,抗生素干預導致克雷伯氏菌(Klebsiella)、Parasutterella、阿克曼氏菌(Akkermansia)相對豐度增多,其余菌屬相對豐度減少。“抗生素+高脂飼料組”對比“生理鹽水+高脂飼料組”結果顯示,除阿克曼氏菌(Akkermansia)、Dubosiella、Alloprevotella、Mucispirillum菌屬不具有統計學差異外,其余均具有統計學差異(P0.05或P0.01),其中,抗生素干預除引起Parasutterella相對豐度增加外,其余菌屬相對豐度均減少。“抗生素+高葡萄糖飼料組”對比“生理鹽水+高葡萄糖飼料組”結果顯示,除雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Roseburia外,其余菌屬間均具有統計學差異(P0.05或P0.01),其中,抗生素干預除引起克雷伯氏菌(Klebsiella)、Parasutterella、阿克曼氏菌(Akkermansia)相對豐度增多,其余菌屬相對豐度減少。此外,在無抗生素干預的各飼料組之間某些菌種的豐度也存在統計學差異。在門水平上,相比“生理鹽水+普通飼料組”,“生理鹽水+高脂飼料組”的變形菌門豐度顯著升高(P=0.021)。相比“生理鹽水+普通飼料組”,“生理鹽水高+葡萄糖飼料組”未鑒定或未分類菌群(unidentified_Bacteria)和柔膜菌門豐度顯著升高(P=0.037,P=0.005)。相比“生理鹽水+高脂飼料組”,“生理鹽水+高葡萄糖飼料組”的擬桿菌門、未分類菌群(unidentified_Bacteria)和柔膜菌門豐度顯著升高(P=0.024,P=0.035,P=0.004)。在屬水平上,相比“生理鹽水+普通飼料組”,“生理鹽水+高脂飼料組”的Dubosiella、Odoribacter、Butryicimonas、Oscillibacter、Parabacteroides均顯著降低(P0.05),單胞菌屬(Stenotrophomonas)顯著升高(P=0.038)。相比“生理鹽水+普通飼料組”,“生理鹽水+高葡萄糖飼料組”的Intesinimonas、Odoribacter、Anaerotuncus、Candidatus_Saccharimonas、Bilophila、Enterorhabdus均顯著升高(P0.05),Dubosiella顯著降低(P=0.023)。相比“生理鹽水+高脂飼料組”,“生理鹽水高+葡萄糖飼料組”的Dubosiella、unidentified_Ruminococcaceae、Alistipes、Intestinimonas、Odoribacter、Candidatus_Saccharimonas、Butyricimonas、Oscillibacter、瘤胃球菌(Ruminiclostridium)、Tyzzerella均顯著升高。由此可見,復合抗生素的使用引起小鼠隨機血糖的降低,導致C57小鼠的葡萄糖耐受量曲線偏離Giddings曲線模型(R~20.95),可能是由于復合抗生素(青霉素、萬古霉素、甲硝唑、新霉素)非特異、無選擇性地清除了腸道菌群,降低了菌群多樣性與相對豐度,從而降低了腸道菌群對食物的吸收轉化利用率所導致的。同時,本研究所發現的阿克曼氏菌(Akkermansia)在復合抗生素干預之后出現了增長變化,結合已有文獻來看,阿克曼氏菌(Akkermansia)會通過負向調節IFN-γ,改善宿主的葡萄糖耐量,降低宿主的血糖水平。本次實驗通過利用復合抗生素作為腸道菌群的負調控因素,改變了腸道微生態,提示腸道菌群與宿主血糖代謝調控之間存在相關性,但是其中的具體關系還需要深入研究。綜上所述,本研究進一步論證了柔性辟谷技術能夠安全有效地降低志愿者的空腹血糖和空腹胰島素水平,改善肥胖和高血糖等慢性病指標。結合文獻和我們實驗室相關研究,這一結果可能與柔性辟谷技術改善宿主腸道微生態有關。為了研究腸道菌群與宿主血糖代謝的相關性,通過選取四種常見品系小鼠進行口服葡萄糖耐受量實驗,發現各品系小鼠的血糖代謝均符合Giddings曲線模型。選擇其中對血糖敏感度較高的C57小鼠作為實驗對象,利用復合抗生素對腸道菌群進行干預并結合高脂和高葡萄糖等不同飼料喂養動物,發現抗生素處理組小鼠在腸道菌群豐度、多樣性降低、腸道微生態等方面都發生了顯著變化(含部分菌群的顯著增加),伴隨著動物血糖降低,偏離先前的Giddings曲線模型,提示腸道菌群與宿主血糖代謝調控具有密切的相關性,為后續從腸道菌群角度研究宿主血糖代謝調控提供了參考信息。
【圖文】：

圖 1. 柔性辟谷期間志愿者每日體重變化情況（n=12）標變化情況指標因數據不全而剔除。其余 8 名志愿者在柔性辟谷愿者柔性辟谷前后，舒張壓下降（干預前：95.18±.13mmHg）（P=0.003）、收縮壓下降（干預前：137.6410.08mmHg）（P=0.045），，均具有統計學差異。從每日的血壓（左為舒張壓，右為收縮壓）呈穩定的

圖 1. 柔性辟谷期間志愿者每日體重變化情況（n=12）3.2 生理指標變化情況3.2.1 血壓指標血壓有 4 人因數據不全而剔除。其余 8 名志愿者在柔性辟谷期間未出現低血壓現象，8 名志愿者柔性辟谷前后，舒張壓下降（干預前：95.18±9.58mmHg，干預后：84.91±7.13mmHg）（P=0.003）、收縮壓下降（干預前：137.64±12.51mmHg，干預后：125.6±10.08mmHg）（P=0.045），均具有統計學差異。從圖 2 可見，志愿者柔性辟谷期間每日的血壓（左為舒張壓，右為收縮壓）呈穩定的下降狀態。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1

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本文編號：2629212