本文選題：嚴重急性呼吸窘迫綜合征 + SARS冠狀病毒　； 參考：《中國協和醫科大學》2009年博士論文

【摘要】： 嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)是由SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起的急性呼吸道傳染病。SARS傳播速度快、范圍廣、死亡率高,被稱為21世紀初最烈性的傳染病之一。SARS是由冠狀病毒家族的新成員-SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起,它既不是任何一種已知冠狀病毒的突變體,也不是已知冠狀病毒的重組體,是一種未知的冠狀病毒。該病病死率較高,尤其是65歲以上的老人可超過50%。SARS病毒作為一種新的冠狀病毒,其毒力遠遠超過其它已知的家族成員,目前尚無有效治療SARS的抗病毒藥物。人們普遍認為,研制一種安全有效的疫苗、開展人群免疫預防是阻止SARS再次流行最有效的方式。目前,已出現多種有發展前景的SARS-CoV疫苗形式,包括滅活病毒疫苗、基于SARS-CoV結構蛋白制備的DNA疫苗、活病毒載體疫苗等,表位疫苗是近年來新近發展起來的疫苗形式,安全性好,誘導的免疫反應針對性強。在我們的研究中,利用SARS-CoV Spike蛋白來源B細胞表位多肽及其產生的單克隆抗體在SARS-CoV感染細胞及體內的過程中進行作用,對其作用效應加以描述,同時對其作用機制加以探討,以期對SARS-CoV疫苗的研制工作提供有力的科學依據。 本研究中,我們首先在體外利用SARS-CoV Spike蛋白來源的四種B細胞表位多肽所產生的單克隆抗體在SARS-CoV感染Vero-E6細胞時進行作用,在篩選得到對病毒感染有中和作用抗體的同時,發現其中由S(597-625)多肽所制備的單克隆抗體S(597-625)43-3-14在病毒感染的過程中表現出隨抗體濃度增加而細胞受感染增強的現象。隨后我們對四種多肽進行不同組合,先后免疫了h-ACE2轉基因C57小鼠及恒河猴,經檢測動物體內特異性抗體達到穩定水平后,進行SARS-CoV感染,分別于攻毒后2天與6天時間點安樂動物,觀察SARS-CoV作用靶器官肺組織的病理學變化及肺組織內SARS-CoV載量,發現仍然是由S(597-625)多肽免疫的C57小鼠或恒河猴攻毒后在肺組織病理學改變上表現出嚴重的肺間質性肺炎癥狀,病毒載量較對照組及其它免疫組增加。根據該實驗結果,我們又設計應用高、低兩組濃度的S(597-625)43-3-14抗體靜脈注射于恒河猴體內,攻毒后仍選擇相同的時間點安樂恒河猴觀察病理學變化及肺組織的SARS-CoV載量,發現肺組織病理性損傷程度及病毒載量隨抗體濃度的升高而增加,說明S(597-625)43-3-14抗體在體外及體內都可以增強SARS-CoV的感染。 本研究提示,在病毒感染過程中,可能存在一種通過抗體介導的獨立于Fc片段受體之外的非經典ADE機制,當體內已經存在抗體或抗體結合力較低的情況下,這種ADE現象可以減弱、平衡掉其它中和抗體的作用甚至增強病毒的感染。盡管ADE的作用機制未被完全闡明,但是這種作用可被認為是研發預防各種感染的疫苗的一個最大障礙,而我們的研究將為SARS-CoV疫苗的研究及評價提供嚴謹有力的科學依據。 手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是以手掌、腳掌、口腔黏膜上發生水皰為特征的一種病毒性皮膚病,其病原體以柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CoxAl6)和人腸道病毒71型(human enterovirus 71, EV71)最為常見,埃可病毒和其他一些腸道病毒亦可致病。疾病進程為自限性,一般預后良好,少數病例可引發心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等嚴重并發癥甚至死亡。我國手足口病感染流行的全局性情況、病毒流行株的地區分布及變異性等都還有待進一步查明。2000-2005年,金奇等連續6年對深圳的手足口病流行情況進行監測,結果發現,2／3的病例是由CAl6病毒感染引起,1／3由EV71病毒感染導致。而2007年在山東局部流行的手足口病70%的病例是EV71病毒感染,CoxA16病毒感染只占總數的20%左右 全國今年已報告手足口病115618例,死亡50例。衛生部新聞辦公室主任鄧海華指出,2009年3月全國通過傳染病網絡直報系統報告的手足口病病例是54713例,死亡31例。從今年年初到4月7號,網絡直報顯示,全國累計報告手足口病例115618例,其中重癥773例,死亡50例。 EV71病毒感染多呈隱性,顯性表現中,一般病例感染后進入HFMD/皰疹性咽峽炎階段,在原發病的基礎上,少數患者可累及神經系統、呼吸系統和循環系統。神經源性肺水腫(neurogenic pul-monary edema, NPE)病死率高,是EV71病毒感染的重要并發癥和主要死因,也是本次阜陽市疫情中部分重癥患兒的主要死因,表現為起病第1～3天內突然發生心動過速、呼吸困難、紫紺和休克，，胸片顯示雙側對稱性非心源性肺水腫,90%病例于發病后12h內死亡[66],其嚴重性值得關注。 手足口病嚴重影響青少年兒童的身心健康,除要加強人群本身的健康狀況,提高自身免疫力,以有效抵御病毒的侵襲外,啟動EV71病毒疫苗的研制工作將成為手.足口病防治的重中之重。 我們利用安徽阜陽來源的病毒,作為疫苗制備的模版,根據NCBI已測序的EV71毒株-EU701832序列,將病毒的2193個氨基酸依次分割成含100～150個氨基酸的肽段進行表達。表達后的肽段作為抗原進行免疫學觀察,并對抗原刺激機體產生的抗體進行免疫學檢測及細胞保護性實驗。結果表明1#,5#,6#,7#,10#,13#,14#,18#,19#,20#抗原效果最佳,可以作為下一步動物保護性實驗候選疫苗。其中1#抗原屬于VP4蛋白,5#、6#抗原屬于VP3蛋白,7#抗原屬于VP1蛋白,10#抗原屬于2A蛋白,13#、14#抗原屬于2C蛋白、18#抗原屬于3C蛋白,19#、20#屬于3D蛋白。我們決定應用1#,5#,6#,7#,10#,13#,14#,18#,19#,20#10個抗原,作為疫苗組合的基礎單位,進行三三融合,增加抗原的免疫效應。 綜上,我們的工作為接下來進行的抗原肽段動物保護性實驗及今后的EV71病毒疫苗制備及鑒定工作打下堅實的理論基礎,提供了科學的實驗依據。
[Abstract]:Severe acute respiratory syndrome ( SARS ) is an acute respiratory disease caused by SARS - CoV . SARS is one of the most virulent infectious diseases in the early 21st century .



In this study , the monoclonal antibody produced by four B - cell epitopes of SARS - CoV spike protein was firstly used to infect Vero - E6 cells infected with SARS - CoV . The results showed that the monoclonal antibody S ( 597 - 625 ) 43 - 3 - 14 prepared by S ( 597 - 625 ) polypeptide was infected by infection .



This study suggests that , in the course of viral infection , there may be a non - classical ADE mechanism mediated by an antibody independent of the Fc fragment receptor , which may attenuate , balance , or even enhance the infection of the virus when an antibody or antibody binding force has been present in the body . Although the mechanism of action of ADE is not fully elucidated , this effect may be considered to be a major obstacle to the development of vaccines for the prevention of various infections , and our study will provide a rigorous scientific basis for the research and evaluation of SARS - CoV vaccines .



Hand , foot and mouth disease ( HFMD ) is a kind of viral skin disease characterized by the occurrence of blisters on the palms , soles and oral mucous membranes . The pathogen is the most common cause of infection of the coxievirus A16 ( CoxAl6 ) and human enteroviruses 71 ( EV71 ) . The disease progression is self - limited , the general prognosis is good , few cases can cause myocarditis , pulmonary edema , aseptic meningoencephalitis , etc .



According to Deng Haihua , director of public information office of the Ministry of Health , there were 5,713 cases of hand - and - mouth disease reported in the national reporting system of infectious diseases in March 2009 , and 31 cases died . From the beginning of the year to April 7 , the network reported that there were 115618 cases of hand - foot - mouth cases in China , including 773 cases and 50 deaths .



The EV71 virus infection is recessive and dominant , and the general case is infected with HFMD / HERPES . On the basis of the original pathogenesis , few patients may be involved in the nervous system , respiratory system and circulatory system . It is the main cause of EV71 virus infection . It is also the main cause of death of EV71 virus infection .



Hand - foot - mouth disease seriously affects the physical and mental health of young and young children . In addition to strengthening the health of the population and enhancing the immunity of the young children , the development of the EV71 virus vaccine will become a hand .



The results showed that 1 # , 5 # , 6 # , 7 # , 10 # , 13 # , 14 # , 18 # , 19 # and 20 # antigen were the best . and carrying out the three - three fusion to increase the immune effect of the antigen .



In conclusion , our work lays a solid theoretical foundation for the protection experiment of antigenic peptide section and the preparation and identification of EV71 virus vaccine in the future , and provides scientific experimental basis .
【學位授予單位】：中國協和醫科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1985252