本文選題：Cry1Ah蛋白 + 殺蟲特異性　； 參考：《中國農業科學院》2013年博士論文

【摘要】：蘇云金芽胞桿菌因其對多種害蟲具有殺蟲活性，不污染環境，對人畜無害，因而在害蟲的生物防治中得到了廣泛的應用。cry1Ah1基因是本實驗室分離克隆的具有自主知識產權的殺蟲基因，由于其編碼的Cry1Ah蛋白對多種鱗翅目害蟲具有較高的殺蟲活性，目前cry1Ah1基因被應用于轉基因玉米和水稻的研究中。 為了評價cry1Ah1基因對非靶標昆蟲的安全性，本文首先對Cry1Ah蛋白對鱗翅目中重要的經濟昆蟲家蠶（Bombyxmori）進行了活性測定，結果表明：Cry1Ah蛋白對家蠶的致死中濃度（LC50）大于500μg/mL。這不僅明確了對棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）等害蟲高毒力的Cry1Ah蛋白（LC50=7.04μg/g）對非靶標昆蟲（家蠶）是安全低毒（LC50500μg/mL），更重要的是為cry1Ah1基因的推廣及應用提供了理論依據。 Cry1Ah的這種特性恰恰與本實驗室分離克隆的另一個擁有自主知識產權殺蟲基因cry1Ai相反，Cry1Ai蛋白對家蠶表現出很高的毒力（LC50=5.25μg/mL），但對棉鈴蟲則表現出較低的活性（LC50500μg/g），而兩者的氨基酸相似性為84%，并且擁有相似的三維結構。基于這種發現，本研究旨在揭示Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲等農業害蟲高毒力、對經濟昆蟲家蠶相對安全低毒的分子機制。 本文以Cry1Ah蛋白為研究重點，以Cry1Ai蛋白為對照材料，一方面通過構建定點突變體、截短片段以及Loop突變體，明確Cry1Ah蛋白殺蟲活性相關位點、Cry1Ai蛋白的殺蟲活性區域，以及兩者與殺蟲特異性相關的Loop區域。另一方面，利用配體垂釣平臺分別分析Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白在棉鈴蟲和家蠶刷狀緣膜微囊泡（BrushBorderMembraneVesicles，簡稱BBMVs）上的特異性結合蛋白。主要研究結果如下： （1）利用定點突變的方法構建了Cry1Ah蛋白DomainⅠ和DomainⅡ上7個突變體，對比Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲的生物活性發現，Cry1Ah蛋白DomainⅠ中α-6螺旋上第206位氨基酸突變為丙氨酸時，其對棉鈴蟲的殺蟲活性略有降低，而在DomainⅡ上Loop3的第463位添加多個天冬酰胺時，能夠降低其對棉鈴蟲的殺蟲活性。 （2）構建了26個Cry1Ai蛋白的截短片段，通過對小菜蛾的生物活性測定，將Cry1Ai蛋白對小菜蛾（Plutellaxylostella）的最小活性區域精準定位為第36I到605I氨基酸殘基。 （3）通過分析比較Cry1Ah/Cry1Ai毒素在棉鈴蟲和家蠶中腸BBMVs上的結合蛋白，探尋結合蛋白與殺蟲特異性的關系。研究發現，Cry1Ah蛋白與棉鈴蟲BBMVs上的氨肽酶N（AminopeptidaseN，簡稱APN）能夠特異的結合，而在家蠶的BBMVs上沒有檢測到這種高親和力的結合，這可能是Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲殺蟲特異性的原因。而Cry1Ai蛋白在家蠶的BBMVs上也存在一些特異的結合蛋白，但這些結合蛋白仍需進一步驗證。 （4）為了進一步確定Cry1Ah蛋白與棉鈴蟲APN特異性結合的原因，本研究分析比較Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白的氨基酸序列和三維結構，研究發現，兩者在受體結合區域的主要差別在DomainⅡ的Loop2和Loop3上，通過構建Loop互換突變體，以及比較突變體的生物活性，發現Cry1Ah和Cry1Ai蛋白Loop2的互換使得Cry1Ai蛋白獲得了對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ai-hloop2：LC50=64.23μg/g），而Cry1Ah蛋白則失去了對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ah-iloop2：LC50500μg/g）；但Loop2的互換并沒有改變兩種蛋白對家蠶原有活性（Cry1Ai-hloop2：LC50=11.60μg/mL；Cry1Ah-iloop2：LC50500μg/mL），這說明DomainⅡ的Loop2與棉鈴蟲殺蟲特異性密切相關。而兩個蛋白Loop3互換時，不但沒有使Cry1Ai蛋白沒有獲得對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ai-hloop3：LC50500μg/g），反而導致Cry1Ah蛋白失去了對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ah-iloop3：LC50500μg/g），這說明Loop3對Cry1Ah和Cry1Ai蛋白保持原有的對棉鈴蟲的殺蟲活性比較重要。 Cry1Ah蛋白對非靶標昆蟲（家蠶）安全性的明確，，將有利于cry1Ah1基因的推廣應用，同時也為新型cry基因的發掘和應用提供篩選和評價標準；Cry1Ah蛋白殺蟲特異性相關受體的確定，以及Cry1Ah蛋白上與殺蟲特異性相關氨基酸區域的明確，初步揭示了Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲殺蟲特異性的分子機制，為cry1Ah1基因的推廣應用奠定了堅實的理論基礎，同時也為其它Cry蛋白的定向改造提供重要借鑒。
[Abstract]:The Bacillus thuringiensis has the insecticidal activity to many kinds of pests, does not pollute the environment and is harmless to the human and animal. Therefore, the.Cry1Ah1 gene has been widely used in the biological control of the pests. It has the independent intellectual property of the insecticidal gene, which is isolated and cloned in our laboratory. Because of its coding Cry1Ah protein, it has a better effect on a variety of Lepidoptera pests. High insecticidal activity, the cry1Ah1 gene has been applied to the research of transgenic maize and rice.
In order to evaluate the safety of cry1Ah1 gene for non target insects, the activity of Cry1Ah protein to the important economic insect (Bombyxmori) in Lepidoptera (Bombyxmori) was measured. The results showed that the lethal concentration of Cry1Ah protein (LC50) was greater than 500 mu g/mL., which was not only clear to the high insect pests of cotton bollworm (Helicoverpaarmigera) and so on. The toxic Cry1Ah protein (LC50=7.04 g/g) is a safe and low toxicity (LC50500 mu g/mL) to the non target insect (silkworm), and more importantly, it provides a theoretical basis for the promotion and application of cry1Ah1 gene.
This characteristic of Cry1Ah is the opposite of another independent intellectual property killing gene cry1Ai, which is cloned in our laboratory. Cry1Ai protein shows a high toxicity (LC50=5.25 mu g/mL) to silkworm, but it shows a lower activity (LC50500 mu g/g) to the cotton bollworm (LC50500 mu g/g), and the two amino acid similarity is 84%, and it has a similar three dimension. Structure. Based on this discovery, this study aims to reveal the high toxicity of Cry1Ah protein to cotton bollworm and other agricultural pests, and the molecular mechanism of relatively safe and low toxicity to the Bombyx mori.
In this paper, we focus on Cry1Ah protein and use Cry1Ai protein as the control material. On the one hand, by constructing the fixed-point mutants, truncated fragments and Loop mutants, the insecticidal activity related sites of Cry1Ah protein, the insecticidal activity region of Cry1Ai protein and the Loop region related to the specificity of the insecticides are also identified. On the other hand, the ligands are angled by the ligands. The specific binding proteins of Cry1Ah protein and Cry1Ai protein in the BrushBorderMembraneVesicles (BBMVs) of cotton bollworm and Bombyx mori were analyzed respectively. The main results were as follows:
(1) 7 mutants on Cry1Ah protein Domain I and Domain II were constructed by site directed mutagenesis, and the bioactivity of Cry1Ah protein to Helicoverpa armigera was compared. When Cry1Ah protein Domain I mutated to alanine with 206th amino acids on the alpha -6 spiral, the insecticidal activity of Cry1Ah protein to Helicoverpa armigera was slightly reduced, and 463rd bits of Loop3 in Domain II were added. Adding asparagine can reduce its insecticidal activity against Helicoverpa armigera.
(2) the truncated fragments of 26 Cry1Ai proteins were constructed. By measuring the bioactivity of the diamondback moth, the Cry1Ai protein was accurately positioned as the 36I to 605I amino acid residues in the smallest active region of the Plutella xylostella (Plutellaxylostella).
(3) through the analysis and comparison of the binding proteins of Cry1Ah/Cry1Ai toxin on BBMVs in the midgut of Helicoverpa armigera and silkworm, the relationship between binding proteins and insecticidal specificity was explored. It was found that the Cry1Ah protein and the aminopeptidase N (AminopeptidaseN, APN) on the BBMVs of cotton bollworm could be specifically bonded, but the high affinity was not detected on the BBMVs of the silkworm. The combination of forces may be the reason for the specificity of Cry1Ah protein against Helicoverpa armigera, and the Cry1Ai protein also has some specific binding proteins in the BBMVs of the silkworm, but these binding proteins still need to be further verified.
(4) in order to further determine the reason for the specific binding of Cry1Ah protein to the APN of cotton bollworm, this study compared the amino acid sequence and three-dimensional structure of Cry1Ah protein and Cry1Ai protein. It was found that the main differences in the receptor binding regions were on the Loop2 and Loop3 of Domain II, by constructing Loop exchange mutants and comparison mutants. It was found that the exchange of Cry1Ah and Cry1Ai Loop2 made the Cry1Ai protein obtain the insecticidal activity (Cry1Ai-hloop2:LC50=64.23, g/g) to cotton bollworm, while the Cry1Ah protein lost the insecticidal activity (Cry1Ah-iloop2:LC50500 u g/g) to the cotton bollworm (Cry1Ah-iloop2:LC50500 u g/g), but the exchange of Loop2 did not change the original activity of the two proteins to the silkworm (C). Ry1Ai-hloop2:LC50=11.60 mu g/mL; Cry1Ah-iloop2:LC50500 mu g/mL), which indicates that Loop2 of Domain II is closely related to the specificity of insecticidal specificity of Helicoverpa armigera. While the two protein Loop3 exchange, not only does not make Cry1Ai protein do not obtain the insecticidal activity (Cry1Ai-hloop3:LC50500 mu g/g) to cotton bollworm (Cry1Ai-hloop3:LC50500 micron g/g), but the Cry1Ah protein is lost to the cotton. The insecticidal activity of Bollworm (Cry1Ah-iloop3:LC50500 g/g) indicates that Loop3 is more important for Cry1Ah and Cry1Ai proteins to maintain their original insecticidal activity against Helicoverpa armigera.
The definite safety of Cry1Ah protein to non target insect (silkworm) will be beneficial to the promotion and application of cry1Ah1 gene. It also provides screening and evaluation criteria for the discovery and application of new cry genes, the determination of Cry1Ah protein specific receptor related to insecticides, and the clear region of the specific amino acid related to the insecticidal protein on the Cry1Ah protein. The molecular mechanism of Cry1Ah protein to insecticidal specificity of Helicoverpa armigera was revealed, which laid a solid theoretical basis for the promotion and application of cry1Ah1 gene, and also provided an important reference for the directional transformation of other Cry proteins.

【學位授予單位】：中國農業科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：S476.1

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本文編號：1844821