目的： 假性維生素D缺乏性佝僂病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets, PDDR),是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病,系編碼25OHD31α羥化酶的CYP27B1基因突變所致,目前基因突變已發(fā)現(xiàn)近四十種,本組前期的研究首次在5名中國PDDR患者中發(fā)現(xiàn)了4個新突變,但這幾個突變對25OHD3Iα羥化酶的功能影響尚未證實(shí)。因此本實(shí)驗(yàn)的主要目的是在構(gòu)建CYP27B1體外過表達(dá)體系的基礎(chǔ)上,研究我組新發(fā)現(xiàn)的2個錯義突變G57V和L333F對25OHD3Iα羥化酶活性的影響,進(jìn)而加深臨床醫(yī)生對于突變型和臨床表型關(guān)系的認(rèn)識。 方法： 1.通過定點(diǎn)誘變將突變引入連接在質(zhì)粒載體pCMVXL5上的CYP27BlcDNA,構(gòu)建突變型CYP27B1基因G57V和L333F,并在體外大量擴(kuò)增,得到大量的載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒DNA。 2.通過陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒至293T人胚腎細(xì)胞,構(gòu)建CYP27B1野生型和突變型基因的體外過表達(dá)體系 3.轉(zhuǎn)染36小時后,向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的底物250HD3,然后放入C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),使野生型和突變型酶在適當(dāng)條件下進(jìn)行體外羥化反應(yīng)； 4.收集細(xì)胞培養(yǎng)液,經(jīng)過提取和C18柱純化,用放免法對不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行250HD3和1,25(OH)2D3濃度的檢測,通過SPSS析因分析,比較突變型與野生型不同基因型之間是否存在顯著差異 5.收集完細(xì)胞培養(yǎng)液后將細(xì)胞提取總蛋白,通過western blot檢測驗(yàn)證野生型和突變型的蛋白在體外是否有表達(dá)及表達(dá)水平是否一致。 結(jié)果： 1. CYP27B1野生型和突變型基因在293T細(xì)胞體外過表達(dá)體系中均有所表達(dá),而且表達(dá)水平一致。 2.體外過表達(dá)的野生型和突變型CYP27B1均具酶活性,可以產(chǎn)生1,25(OH)2D3并被檢測到,突變型CYP27B1組1,25(OH)2D3水平顯著減低,其中G57V和L333F的酶活性分別為野生型的56.8%和70.75%。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了1α羥化酶(CYP27B1)在293T人胚腎細(xì)胞中的體外過表達(dá)模型,并以此為基礎(chǔ),對于在中國人群中首次發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致PDDR的兩個錯義突變進(jìn)行了功能研究。結(jié)果顯示：突變型G57V和L333F的酶活性較野生型顯著減低,且與患者的臨床表型具有一定聯(lián)系。

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R591.44
【目錄】：

【共引文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 崔寧宜;1、北京地區(qū)絕經(jīng)后女性腹主動脈鈣化與骨質(zhì)疏松的關(guān)系2、25羥維生素D-1α羥化酶（CYP27B1）突變基因的功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張媛;1，25-二羥維生素D_3對COPD患者肺功能和生活質(zhì)量的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

2 盧靜;模擬空間環(huán)境誘導(dǎo)的氧化損傷、骨丟失抑制劑的篩選及G-B-R組合物的防護(hù)活性研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2013年

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊楊,高成閣;色胺酸羥化酶與抑郁癥及自殺的分子遺傳學(xué)研究[J];中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué);2005年04期

2 王艷林,余斌杰,梁奕銓,曲穎蕃,胡少梅,歐香忠;苯丙氨酸羥化酶測定和初步評價[J];華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1996年S1期

3 吳秉毅，許紹輝，孔憲濤;SIRPH在肝纖維化中的意義[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1996年01期

4 張菊娥,陳宗德,付潤芳,張翠英,張國太;肺癌患者血淋巴細(xì)胞芳香烴羥化酶誘導(dǎo)性及血清脂質(zhì)過氧化水平測定[J];河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1997年04期

5 張進(jìn)祿,徐群淵,田竟生,楊慧,鄭少鵬,劉玉軍;轉(zhuǎn)基因細(xì)胞腦內(nèi)移植治療帕金森病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J];解剖學(xué)報;1997年02期

6 陳興明!100730,陳詠梅,倪道鳳!100730,徐春曉!100730,李予魯,李奉榮!100730,葉世雋;電刺激大鼠嗅粘膜對嗅球酪氨酸羥化酶的影響[J];中華耳鼻咽喉科雜志;2001年02期

7 謝紅光，肖洲生，，黃松林，許振華，何楠，盧義欽，夏暉，周宏灝;中國人S－美芬妥英羥化酶的兩種突變基因型[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;1996年03期

8 李淑婷,楊慧,蔡青,張進(jìn)祿,孫曉紅,徐群淵;酪氨酸羥化酶mRNA在基因治療帕金森病大鼠模型后的腦內(nèi)表達(dá)[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1997年03期

9 申麗靜;汪釗;;柚皮素酶法結(jié)構(gòu)修飾的研究進(jìn)展[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2006年06期

10 殷淑芳,肖水珍;先天性腎上腺皮質(zhì)增生,17d羥化酶缺乏型1例[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2001年01期