【摘要】：【研究背景】脂肪移植技術因脂肪組織來源豐富,獲取方便,操作相對簡單、微創,故在美容和修復重建領域得到越來越廣泛的應用。然而,術后移植的脂肪容易出現脂肪結節、囊泡等并發癥,更因術后低且不穩定的脂肪容積保有率(20 80%)嚴重制約了該技術進一步發展。2001年Zuk等學者第一次從人的脂肪組織中分離出具有多向分化能力的干細胞,命名為脂肪來源間充質干細胞(ADSCS)。ADSCS具有轉分化為血管內皮細胞和脂肪細胞的能力,具有抗組織細胞凋亡和促進移植物血管化的作用,因此利用ADSCS輔助自體脂肪移植能明顯降低脂肪結節、囊泡等并發癥的發生幾率,降低脂肪吸收率,進而提高移植脂肪成活質量和長期容積保有率。然而,消瘦的患者缺乏可以獲得充足ADSCS的脂肪組織;ADSCS的分化與再生能力隨年齡的增加而減弱,故難以從老年患者體內獲得高活力的ADSCS;糖尿病、紅斑狼瘡等自身免疫相關性疾病改變了該類患者ADSCS的細胞屬性,使其自身的ADSCS喪失了細胞保護和再生的功能。基于以上原因,傳統的ADSCS輔助脂肪移植術在消瘦的、老齡的、自身免疫相關性疾病的患者中無法有效展開。鑒于ADSCS具有低免疫性和免疫抑制能力,利用同種異基因充足、健康的ADSCS輔助自體脂肪移植可能是解決上述問題有效的方法。【研究目的】1、通過對Lewis和BN大鼠腹股溝皮下脂肪和附睪周圍脂肪組織的ADSCS獲取、培養、鑒定,探討哪個部位來源的ADSCS具有更高的生物活性。2、通過建立刀豆蛋白刺激脾單個核細胞(MNCs)增殖的模型,探究不同濃度的ADSCS對于MNCs增殖的影響;探討同基因和異基因ADSCS的低免疫原性和免疫抑制能力。3、建立BN大鼠來源的ADSCS輔助Lewis大鼠脂肪移植的動物模型,觀察同種異基因ADSCS是否降低了自體脂肪移植過程中的細胞損傷程度;是否促進移植脂肪的再血管化過程;是否提高了移植脂肪的長期容積保有率。并檢測了移植的同種異基因ADSCS和宿主間可能發生的免疫反應。【研究方法】1、Lewis和BN大鼠的腹股溝皮下脂肪和附睪周圍脂肪通過酶消化法來分離和培養ADSCS,通過表面分子檢測和誘導分化鑒定其是否為ADSCS;并且測定兩種部位來源細胞的形態學、生長曲線、細胞周期。2、利用流式細胞分析儀檢測與免疫原性相關的細胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-I、MHC-II;建立ADSCS與活化的MNCs共培養的細胞模型,檢測在此共培養體系中同基因和異基因ADSCS對脾單個核細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、以及CD4/CD25/Foxp3 Treg細胞比例的影響。3、建立BN大鼠來源的ADSCS輔助Lewis大鼠自體脂肪移植的動物模型。在脂肪移植術后7天和14天,檢測了HE組織染色、脂周蛋白、原位細胞凋亡等反映脂肪組織細胞損傷指標;進行了VEGF的ELAISA和CD34的免疫組織化學等反映移植組織血管化指標的檢測;進行了外周血CD4/CD8和CD4/CD25/Foxp3等反映免疫反應指標的檢測。【結果】1、Lewis和BN大鼠獲取的ADSCS,無種屬上的明顯區別;但與腹股溝皮下脂肪相比,兩種大鼠附睪周圍脂肪組織的纖維組織更少,在進行剪碎脂肪操作時更加省時省力;附睪脂肪組織純度更高,單位質量獲取的ADSCS的數量更多;而且附睪來源的ADSCS具有更早的貼壁時間,更佳的增殖能力和更短的傳代時間;綜上所述,附睪脂肪組織來源的ADSCS更加適合作為實驗細胞。2、流式細胞儀檢測發現,ADSCS不表達CD40、CD80、CD84、MHC-II和中度表達MHC-I。在ADSCS與活化的MNCs共培養的細胞模型中,ADSCS明顯降低了MNCs的增殖,增加了處于G0/G1期的MNCs細胞比例;抑制了MNCs的凋亡;提高了具有負向免疫調節能力的CD4/CD25/Foxp3 Treg細胞的比例。3、在建立BN大鼠來源的ADSCS輔助Lewis大鼠脂肪移植的模型中,發現異基因和同基因ADSCS均能減輕移植術后7天、14天的脂肪細胞損傷與凋亡;增加移植物血管密度和血管內皮生長因子的含量;提高術后3月時脂肪容積保有率。移植術后7天、14天的宿主外周血中CD4/CD8比值和CD4/CD25/Foxp3 Treg含量在異基因干細胞組和對照組之間并無統計學差異。【結論】1、與腹股溝皮下脂肪相比,Lewis和BN大鼠附睪周圍脂肪來源的ADSCS獲取效率更高和增殖傳代能力更強。2、ADSCS具有低免疫原性和免疫抑制性。同基因和異基因ADSCS均能降低Lewis大鼠的已經活化的MNCs增殖、抑制MNCs的細胞分裂、提高MNCs中CD4/CD25/Foxp3+Treg細胞的含量。但是并不促進MNCs凋亡的發生。3、在建立BN大鼠來源的ADSCS輔助Lewis大鼠脂肪移植的動物模型中,異基因ADSCS和同基因ADSCS一樣能夠降低術后7天、14天的細胞損傷和凋亡;促進移植物的血管化進程;提高移植脂肪組織的長期容積保有率;而且未發現異基因ADSCS引起的免疫排斥反應。
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【學位授予單位】：第二軍醫大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R622

【參考文獻】

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1 解琳娜;小鼠骨髓間充質干細胞免疫學特性及其對急性移植物抗宿主病的影響[D];第二軍醫大學;2006年

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本文編號：2302164