【摘要】：性別的出現(xiàn)是生物進(jìn)化史上重大的進(jìn)步之一,性別決定機(jī)理研究是科學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,哺乳動(dòng)物基因決定性別學(xué)說(shuō)因SRY基因的發(fā)現(xiàn),而逐漸被人們接受。然而鳥(niǎo)類(lèi)性別決定和分化過(guò)程與哺乳動(dòng)物存在很大差異,雖然鳥(niǎo)類(lèi)的Z和W染色體上都發(fā)現(xiàn)了與性別決定相關(guān)的基因,但是并沒(méi)有類(lèi)似哺乳動(dòng)物起決定作用的SRY基因。有趣的是自然條件下牝雞司晨的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象在史書(shū)上也早有記載,研究者也發(fā)現(xiàn)雞的性別決定和分化過(guò)程容易受到性激素變化的影響。由于性反轉(zhuǎn)雞是研究鳥(niǎo)類(lèi)性別決定和分化的理想模型,以及其潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值,近年來(lái)研究者們嘗試各種方法研究性反轉(zhuǎn)雞。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生雄性表型性反轉(zhuǎn)雞有著豐富的經(jīng)驗(yàn),已經(jīng)具備成熟的性腺摘除手術(shù),并能夠通過(guò)激素誘導(dǎo)獲得雄性表型性反轉(zhuǎn)雞。但面臨的問(wèn)題有:雄性表型性反轉(zhuǎn)雞的反轉(zhuǎn)性狀不穩(wěn)定,雄性表型性反轉(zhuǎn)雞輸精管發(fā)育是否完善。對(duì)此,本研究使用依西美坦(芳香化酶抑制劑)+睪酮兩種藥物單獨(dú)或聯(lián)合用藥分別處理種蛋,在小雞孵出后第3~5d摘除性腺,并交叉分組繼續(xù)藥物跟蹤誘導(dǎo)。觀察雄性表型性反轉(zhuǎn)雞表觀性狀的變化,在雞長(zhǎng)到1月齡的時(shí)候取血量豐富的副羽毛囊組織通過(guò)PCR驗(yàn)證雞的遺傳性別,并分別在1月齡,2月齡,3月齡,4月齡取性腺,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定雞性別決定相關(guān)基因在性腺內(nèi)表達(dá)的情況,6月齡時(shí)觀察精子形成和輸精管發(fā)育情況。此外本研究通過(guò)體外人工授精探索雄性表型性反轉(zhuǎn)雞精子的可育性。實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D 4個(gè)組,其中A和B組在雞胚中注射依西美坦,C和D組在雞胚中注射依西美坦+睪酮;實(shí)驗(yàn)雞出雛后A和C組注射依西美坦+睪酮,B和D組注射依西美坦。結(jié)果如下:`注射0.7mg依西美坦與注射0.7mg依西美坦+0.5mg睪酮均顯著降低種蛋孵化率,分別在孵化前期和出雛期造成死亡高峰,最終出雛率都低于40%,說(shuō)明依西美坦對(duì)胚胎發(fā)育有較強(qiáng)的毒性。并且添加睪酮處理組中,出殼的雛雞中,弱雛率顯著高于只添加依西美坦組,說(shuō)明過(guò)量睪酮不利于胚胎發(fā)育。1月齡的雞比較,A、B、C和D組雞冠、肉髯發(fā)育比對(duì)照組更突出,而尾巴形狀和好斗的性格則是A和C組更接近對(duì)照組。A,C組睪丸發(fā)育,除了體積略小于對(duì)照組,形狀,色澤都與之相似;B,D組睪丸在1月齡和2月齡時(shí)形狀與對(duì)照組相似,但外表開(kāi)始變得不光滑,顏色不均勻,3月齡的性腺表面粗糙,顏色粉白,沒(méi)有繼續(xù)長(zhǎng)大的趨勢(shì),4月齡時(shí)成淡白色片狀,邊緣不規(guī)則。表明單獨(dú)使用依西美坦跟蹤誘導(dǎo)不能得到表型穩(wěn)定的雄性表型性反轉(zhuǎn)雞,而使用依西美坦中添加睪酮的混合藥劑跟蹤誘導(dǎo),能使雄性表型性反轉(zhuǎn)雞穩(wěn)定表現(xiàn)雄性形狀。DMRT1、SF1、DAX1、AMH、SOX9和P450arom基因在雄性表型性反轉(zhuǎn)雞性腺中均有表達(dá),且組間差異隨日齡增長(zhǎng)逐漸增大。其中DMRT1、AMH和SOX9基因隨雞日齡表達(dá)增加,在A、C組和對(duì)照組中的表達(dá)相對(duì)于B、D組差異越來(lái)愈大,到4月齡時(shí),相對(duì)表達(dá)量差異顯著。睪酮能上調(diào)DMRT1、AMH和SOX9基因,下調(diào)SF1、DAX1和P450基因在雄性表型性反轉(zhuǎn)雞性腺的表達(dá),表明DMRT1、AMH和SOX9基因與睪丸的形成緊密相關(guān)。6月齡A組雄性表型性反轉(zhuǎn)雞表觀雄性性征明顯,打鳴聲音洪亮。解剖可見(jiàn)蠶豆?fàn)?長(zhǎng)3.06厘米,寬1.22厘米,重3.83克)黃白色睪丸,緊致飽滿,輸精管形態(tài)良好。顯微鏡下可見(jiàn)大量鞭毛樣游動(dòng)精子,睪丸切片可見(jiàn)大量排列致密的曲精細(xì)管,管壁中的支持細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞分化良好,排列規(guī)則,并有大量精子。輸精管切片中,近睪丸段切片中能看到大量精子存在;輸精管中段切片管壁變厚,管腔逐漸變細(xì),精子量減少;遠(yuǎn)睪丸段輸精管管腔逐漸縮小被實(shí)質(zhì)填充。表明A組雄性表型性反轉(zhuǎn)雞能夠維持穩(wěn)定雄性性征,并能夠產(chǎn)生精子,但是輸精管在6月齡時(shí)發(fā)育仍不完善,其能否隨年齡增大后通過(guò)自然交配得到下一代尚待進(jìn)一步研究。總結(jié):(1)使用依西美坦和睪酮聯(lián)合誘導(dǎo)能夠獲得表型穩(wěn)定的性成熟雄性表型性反轉(zhuǎn)雞。性成熟性反轉(zhuǎn)雞輸精管前段發(fā)育完整,但是輸精管末端管腔實(shí)質(zhì)性堵塞。(2)睪酮能上調(diào)DMRT1、AMH和SOX9基因,下調(diào)SF1、DAX1和P450arom在雄性表型性反轉(zhuǎn)雞性腺的表達(dá),表明DMRT1、AMH和SOX9基因與睪丸的形成緊密相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S831

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2305374