調(diào)度自動(dòng)化論文:

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 　　摘　要：目的：改良成人成骨細(xì)胞消化培養(yǎng)方法，以滿足在細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行骨代謝性疾病研究的需要。方法：取無(wú)菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量純凈成骨細(xì)胞。細(xì)胞長(zhǎng)至匯合后生成黑色結(jié)節(jié)。分別采用NPP底物法、125I標(biāo)記放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型膠原順序沉淀抽提、SDS－PAGE還原電泳法測(cè)定細(xì)胞上清中成骨細(xì)胞主要特征性分泌物：大量堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原。　結(jié)果：黑色結(jié)節(jié)經(jīng)四環(huán)素染色，熒光顯微鏡下觀察為骨結(jié)節(jié)特征性的金黃色。成骨細(xì)胞上清中AKP分泌量為(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量為(1.875±0.549) ng/ml，明顯高于成纖維細(xì)胞(P＜0.01)。可檢測(cè)到Ⅰ型膠原而無(wú)Ⅲ型膠原。結(jié)論：此改良方法可以在短期內(nèi)得到大量性狀穩(wěn)定成骨細(xì)胞，同時(shí)避免成纖維細(xì)胞混入。
　　 關(guān)鍵詞：成骨細(xì)胞　堿性磷酸酶　骨鈣素　膠原
　　成骨細(xì)胞特征性表型為分泌骨鈣素(OCN)、大量堿性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型膠原’而無(wú)Ⅲ型膠原分泌［1］。我們采用改良骨組織消化培養(yǎng)方法，將骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后’再用胰蛋白酶消化’加快骨細(xì)胞的釋放。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及特征性分泌物檢測(cè)證實(shí)’獲得成骨細(xì)胞數(shù)量多，并與纖維細(xì)胞有明顯區(qū)別。
　　材料與方法
　　一、液體的配制
　　0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO’Detroit’Michigan)溶解于d-Hank’s液，抽濾滅菌。培養(yǎng)液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL’Grand Island’NY)’加20%滅活新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml。低血清培養(yǎng)液為5%滅活新生牛血清，其余同培養(yǎng)液。使用25 cm2培養(yǎng)瓶(NUNCLON’Denmark)。
　　二、骨組織片消化
　　取骨科手術(shù)中獲得的無(wú)菌骨碎片’徹底去除骨膜及軟組織；用無(wú)菌Hank′s液沖洗3次’剪碎至體積小于1mm3；Hank′s液多次沖洗至骨片發(fā)白’放入錐形瓶?jī)?nèi)’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍體積)’37℃水浴中消化(30 min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培養(yǎng)液中’置37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2～3 d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30 min’上清液經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾后’離心10 min(1000 r/min)’去掉上清液’沉淀物用培養(yǎng)液打勻’接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)’重復(fù)3次’直至離心后無(wú)沉淀物為止。
　　將消化后的骨片浸泡于培養(yǎng)液中’2～3 d后’重復(fù)上述胰蛋白酶消化步驟’仍有細(xì)胞釋放’根據(jù)所需細(xì)胞量’可重復(fù)數(shù)次。接種后培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液較渾濁’10 h后即有貼壁細(xì)胞’72 h后’細(xì)胞完全貼壁’可沖洗、換液。此后隔日換液。取第二、三代細(xì)胞，消化后，以1×105/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4 ml’5 d后換低血清培養(yǎng)液6 ml，24 h后收集上清液，分裝于5個(gè)離心管內(nèi)，-18℃保存’用于檢測(cè)。
　　三、成骨細(xì)胞特征性鑒定
　　以皮膚成纖維細(xì)胞作為對(duì)照，鑒定實(shí)驗(yàn)所得成骨細(xì)胞。
　　1.形態(tài)學(xué)觀察:除常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察外，采用趨骨性熒光素標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)生成結(jié)節(jié)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入四環(huán)素’使終濃度為50 μg/ml’培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h’換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，經(jīng)Hank′s液沖洗3次’乙醇梯度脫水’固定’Olympus-Vanox-T顯微鏡落射熒光觀察。
　　2.成骨細(xì)胞上清液AKP檢測(cè):采用磷酸對(duì)硝基苯酯二鈉鹽(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt’NPP’上海麗珠東風(fēng)公司)比色法［2］’無(wú)色p-NPP與AKP在37℃水浴中反應(yīng)生成黃色對(duì)硝基苯p-Nitrophenol’經(jīng)405 nm波長(zhǎng)比色’測(cè)得OD值’換算成國(guó)際單位。
　　3.成骨細(xì)胞上清液中骨鈣素檢測(cè):采用BGP放免試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所)檢測(cè)［3］。根據(jù)放射免疫競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理，125I標(biāo)記OCN和樣品所含OCN與OCN抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，使用分離劑使結(jié)合抗體沉淀，4℃離心后，γ計(jì)數(shù)器測(cè)定沉淀物cpm數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線得到樣品OCN含量。
　　4.成骨細(xì)胞上清液中膠原抽提及檢測(cè):采用中性、酸性Nacl溶液順序沉淀抽提［4］，SDS-PAGE垂直板還原電泳法［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝膠板固定于垂直板電泳槽［5］。電泳液為0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；樣品液為0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚蘭；染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)R250、25%異丙醇和10% HAC；脫色液為5%異丙醇和8%HAC。樣品解凍后’放55℃水浴中變性1 h’加入樣品緩沖液50 μl’每個(gè)樣品點(diǎn)2孔’每孔加樣20 μl’另加Ⅰ、Ⅲ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品’50 mA恒定電流電泳1 h后’每個(gè)樣品第1孔內(nèi)加入100 μl 20%β巰基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)樣品緩沖液’靜置1 h后’13 mA恒定電流電泳12 h’染色液染色1 h’脫色液脫色24 h’拍照片。
討　論
　　一、成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的建立
　　早在20世紀(jì)60年代’Peck和Birge［8］開(kāi)始用膠原酶消化骨片’體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞獲得成功；1975年’Wong等［9］采用多次膠原酶消化’使培養(yǎng)的成骨細(xì)胞得到純化。1985年’Robey和Termin等［10］采用低Ca2+培養(yǎng)液培養(yǎng)骨片獲得成骨細(xì)胞’經(jīng)過(guò)鑒定’比酶消化法得到的細(xì)胞更加純化。本實(shí)驗(yàn)改良上述方法’先使用比膠原酶更便宜的胰蛋白酶進(jìn)行多次消化’胰蛋白酶僅能消化骨小梁表面細(xì)胞周圍的基質(zhì)，而對(duì)于埋藏于骨基質(zhì)中的大量靜止骨細(xì)胞無(wú)作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨組織中殘留的血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及部分成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，因此棄之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，無(wú)細(xì)胞釋放，證實(shí)骨片中僅含有埋藏于基質(zhì)中的骨細(xì)胞，筆耕文化傳播，而無(wú)其它細(xì)胞。骨片在培養(yǎng)液中浸泡后，靜止骨細(xì)胞通過(guò)骨小管內(nèi)細(xì)胞縫隙連接［11］’感知外界溶液濃度變化’特別是鈣離子濃度變化［10］’開(kāi)始活躍起來(lái)’通過(guò)骨細(xì)胞性溶骨作用［12］釋放出來(lái)’在骨片周圍形成貼壁細(xì)胞’但一般要經(jīng)過(guò)2周以上時(shí)間’且貼壁細(xì)胞僅出現(xiàn)于骨片周圍［10］’數(shù)量有限。在骨細(xì)胞釋放出來(lái)以前’再次使用胰蛋白酶可大大加速其釋放速度和數(shù)量’既代替了膠原酶的作用’又可避免成纖維細(xì)胞的混入。消化細(xì)胞接種后，經(jīng)2～3周培養(yǎng)可達(dá)匯合’取第2、3代細(xì)胞檢測(cè)，可避免長(zhǎng)期培養(yǎng)，反復(fù)傳代后引起細(xì)胞分化和表型的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，此方法簡(jiǎn)單、實(shí)用，并可獲得足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞。
電力系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)分析論文  

本文編號(hào)：7891