先天性免疫是宿主抵御病原菌感染的第一道防線,是機體內至關重要的系統性響應元件之一,其不僅可以防止感染和維持生理平衡,還對激活適應性免疫應答至關重要。在先天性免疫激活的過程中,炎癥小體通過激活細胞焦亡從而誘發炎癥反應發生是近年來被解析的關鍵信號。在哺乳動物中,炎癥小體主要由三個組件所組成:Nod樣受體蛋白、接頭蛋白凋亡相關斑點樣顆粒(Apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC)和效應蛋白。接頭蛋白ASC在炎癥小體激活過程中作為該組件的關鍵的連接分子,主要包含兩個結構域:PYD結構域和CARD結構域。當上游受體蛋白識別到外源/內源性刺激信號后,可通過PYD-PYD的同源相互作用來招募ASC,然后通過其CARD結構域將PYD形成的絲狀結構壓縮成斑點,并招募pro-caspase-1,誘導IL-1beta和IL-18等炎癥因子的成熟和釋放。然而,在硬骨魚中,炎癥小體激活介導細胞焦亡的分子機制還有待進一步研究,因此,本論文擬以海水養殖經濟魚種大菱鲆為研究對象,鑒定介導炎癥小體激活的關鍵組件,并解析其抗細菌感染分子機制,尋找有效的關鍵分子靶標,為水產養殖魚類的病害防控提供新思路。本論文以哺乳動物上已經鑒定的相關炎癥小體激活分子為基礎,通過RACE技術克隆得到大菱鲆炎癥小體激活的相關調控基因,包括SmGSDME、caspase-3和SmASC。通過多序列比對和進化樹分析發現,不同物種中GSMDE的N端相對保守,其中大菱鲆的SmGSMDE和大黃魚的DFNA5親緣最為接近,且在N端具有一段親膜結構域。而caspase-3的序列在整個生物進化過程中相對保守,且與許氏平鲇caspase-3的親緣關系最近,其沒有跨膜結構域。同時,大菱鲆的ASC和哺乳動物的ASC結構高度保守,均具有典型的PYD和CARD結構域,并且,從進化角度,其和牙鲆的ASC的親緣關系最近。鑒于ASC在炎癥小體組件形成過程中發揮的重要橋接功能,本論文擬進一步探索SmASC的功能。首先,經過表達SmASC蛋白后,采用DSS交聯分析發現,SmASC蛋白能夠形成典型的寡聚化特征。其次,在HEK293T細胞中過表達SmASC蛋白后,采用免疫熒光分析發現,SmASC蛋白能夠在細胞內形成斑點狀結構,并且PYD和CARD結構域在ASC寡聚化過程中均發揮了關鍵作用。然后,進一步分析了大菱鲆不同臟器中SmASC的轉錄水平發現其主在肝和肌肉中具有相對高的表達。最后,我們通過細菌腹腔注射感染發現,鰻弧菌和殺魚愛德華氏菌侵染大菱鲆均能夠誘導SmASC在不同器官中出現顯著上調表達,顯示其在抗細菌感染過程中可能發揮了重要功能。為了進一步探索SnASC在抗細菌感染分子機制,本論文采用活體注射siRNA對大菱鲆SmASC進行敲降后,通過殺魚愛德華氏菌腹腔注射感染發現,SmASC敲降魚體中細菌的定植顯著增加。其次,采用活體注射SmASC過表達質粒后,通過殺魚愛德華氏菌腹腔注射感染發現,SmASC過表達魚體中細菌的定植量顯著減少。綜合上述結果,本論文揭示了SmASC在大菱鲆抗細菌感染過程中發揮了重要的作用,為進一步鑒定大菱鲆的受體蛋白并解析其下游效應蛋白在抗感染先天免疫應答中發揮的分子機制奠定了基礎。
【學位單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

華東理工大學碩士學位論文?第５頁??同上面兩種炎癥小體不同的是ＮＬＲＣ４受體由三個結構域組成，包括Ｎ端的ＣＡＲＤ，??中間的ＮＢＤ以及Ｃ端的ＬＲＲ。因為有ＣＡＲＤ結構域，而沒有ＰＹＤ結構域，ＮＬＰＣ４炎??癥小體的組裝不需要接頭蛋白ＡＳＣ，但是在ＡＳＣ存在的情況能夠增強炎癥反應，同時??也有證據表明缺少ＡＳＣ后，ＮＬＲＣ４通過ＣＡＲＤ－ＣＡＲＤ相互作用招募ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１，足??夠引發ｃａｓｐａｓｅ－１和ＧＳＤＭＤ引發的細胞焦亡，但是沒有ＩＬ－ｌｂ／ＩＬ－１８的成熟丨３７１。另外，??ＬＲＲ在ＮＬＲＣ４激活過程中起抑制作用，因為ＮＬＲＣ４缺少丨，ＲＲ結構域后也能激活??ｃａｓｐａｓｅ－１。目前鑒定到ＮＬＲＣ４的激活劑有三種：細菌的鞭毛、三型分泌系統的通道蛋??白和基座蛋白［３８］。在ＮＬＲＣ４炎癥小體激活過程中，ＮＡ１Ｐ蛋白發揮著重要的功能，細菌??的鞭毛蛋白、三型分泌系統的通道蛋白和基座蛋白不能被ＮＬＲＣ４所識別，需要在ＮＡＩＰ??蛋白的幫助Ｆ形成復合體，使ＮＬＲＣ４的構象發生改變，暴露出來的ＣＡＲＤ結構域與??ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１相互作用，組裝成ＮＬＲＣ４炎癥小體使ｃａｓｐａｓｅ－丨成熟，引發下游的炎癥反??應【３８，３９］。??

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本文編號：2888111