MicroRNAs(miRNAs)在肌肉發育中發揮重要功能,它們參與肌肉的增殖、再生和修復等過程,發揮著調控肌肉數量及質量的功能。Dmrt2b(doublesex and mab-3 related transcription factor 2b)已經被證實參與斑馬魚(Danio rerio)慢肌的發育,作為dmrt2b的同源基因,dmrt2a在斑馬魚肌肉發育中的功能尚不清楚。本研究發現,在斑馬魚中敲降dmrt2a會造成胚胎發育的嚴重缺陷,并且引起快肌標記基因myhz-2的下調和慢肌標記基因myhz-5的上調。生物信息學預測dmrt2a是mi R-203的一個候選靶基因,mi R-203有兩個亞型,mi R-203a和mi R-203b,兩者之間只有一個堿基不同,且它們的核心序列完全相同,本研究選用mi R-203a作為研究對象。熒光素酶報告實驗證實,mi R-203能夠靶向結合dmrt2a 3?UTR來抑制dmrt2a的表達。在斑馬魚胚胎中注射mi R-203a mimic后,dmrt2a的表達受到了抑制。與敲降dmrt2a相似,mi R-203a過表達之后,導致myhz-2的下調和myhz-5的上調。本研究表明mi R-203a能夠直接調控dmrt2a的表達進而調控快肌和慢肌的分化,斑馬魚中過表達mi R-203a和敲降dmrt2a都會損害快肌的發育并且促進慢肌的發育。生物信息學預測igf2bp1(insulin-like growth factor-2 m RNA-binding protein 1)也是mi R-203的候選靶基因,本研究發現,在斑馬魚胚胎中過表達mi R-203a會造成igf2bp1的表達下調,這說明mi R-203可能潛在結合igf2bp1,igf2bp1是mi R-203的潛在靶基因。在斑馬魚胚胎中敲降igf2bp1不會對斑馬魚的表型及肌肉發育造成影響,表明在斑馬魚胚胎中igf2bp1與肌肉發育沒有功能關聯。進一步研究發現,敲降igf2bp1會導致肝臟體積變小,肝細胞標記基因fabp10a的表達量減少,同時內胚層標記基因gata6和foxa3的表達沒有變化。利用基因芯片技術對注射Cont-MO和igf2bp1-MO后兩組芯片中基因的表達譜進行了分析,igf2bp1-MO組芯片中fabp10a的表達量顯著下調,而gata6和foxa3的表達在兩組芯片中則無差異。igf2bp1突變體(igf2bp1-/-)斑馬魚與WT(wild type)斑馬魚在外部形態上無差異,但是在igf2bp1-/-斑馬魚胚胎中,肝臟的體積變小,fabp10a的表達下調,gata6和foxa3的表達沒有變化。本研究表明,igf2bp1在斑馬魚早期肝臟發育過程中是肝臟生長所必需的。綜上所述,在斑馬魚胚胎發育中dmrt2a和igf2bp1分別在肌肉發育和肝臟發育中起重要作用。
【學位單位】：華中農業大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 miRNA 生物合成過程（Liu et al 2007）Fig. 1-1 miRNA biogenesis1.3 miRNAs 在肌肉發育中的功能miRNAs 在肌肉發育和疾病中發揮重要功能，肌肉特異 miRNAs 又稱之為myo-miRNAs，包括 miR-1、miR-206 以及 miR-133a/b 等（Sempere et al 2004,Baskerville and Bartel 2005, Chen and Lodish 2005），它們參與肌肉的增殖、再生、重塑和修復過程，發揮著調控肌肉質量以及促進和維持身體內穩態的功能（Mitchelsonand Qin 2015, Diniz and Wang 2016）。miR-206 特異存在于骨骼肌中，miR-1 和miR-133a/b 在心肌中也有表達（Townley-Tilson et al 2010）。miR-27a 能夠結合肌肉抑制素，促進成肌細胞的增殖，可能也是 myo-miRNAs 的一員（Huang et al 2012）。一些 miRNAs 在肌肉中的功能見表 1-1（Table 1-1）。

Dmrt2a 和 igf2bp1 在斑馬魚胚胎發育中的功能研究胎由于細胞增殖的障礙以及肝細胞凋亡的顯著增加而不能形成肝臟出芽（Sadler et a2007）。Gata5 突變體呈現出肝臟體積變小甚至肝臟整體缺失的表型。在斑馬魚中單獨敲除 gata4 或 gata6 會導致肝臟、胰腺以及小腸等起源于內胚層的器官的發育缺陷但在斑馬魚中同時敲除 gata4 以及 gata6，其胚胎則出現完全無肝臟的表型，這表明在斑馬魚早期肝臟發育過程中，gata4和gata6都是必需的（Holtzinger and Evans 2005Zhao et al 2008）。綜上所述，斑馬魚肝臟各時期及其特異表達基因如下圖所示：圖 1-2（Fig. 1-2）。

向斑馬魚單細胞胚胎中顯微注射 Cont-MO 和 dmrt2a-MO，每個胚胎的注射量約為 5ng。比較兩個注射組可以發現，相較于 Cont-MO 注射組，dmrt2a-MO 注射組的胚胎在24hpf時出現了不正常的身體彎曲并伴隨著軀干短小的表型，如圖2-1A-b，c。為了驗證這種表型是否特異出現在 dmrt2a-MO 注射組胚胎中，我們又進行了挽救實驗。共注射 dmrt2a mRNA 和 dmrt2a-MO 后發現之前出現的不正常的身體彎曲和軀干短小的表型得到了明顯的改善，并根據胚胎發育的畸形程度，劃分為正常表型、輕度畸形和重度畸形，并對三組注射組的胚胎表型進行了統計，結果見圖 2-1B。
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本文編號：2893433