胸腺素β4作為新近發現的能同時具有抑制細菌生長和促進傷口愈合兩種功能的重要基因,在斑節對蝦中未展開研究。本研究克隆了斑節對蝦胸腺素β4(Pmβ4)基因,并對其在抗菌免疫和傷口愈合中的作用進行了探究。通過液體培養基法和酶聯免疫吸附實驗研究了Pmβ4在體外的抑菌活性。借助RNAi和過表達等技術明確了Pmβ4對血淋巴中副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)的清除作用以及Pmβ4對對蝦存活率的影響。通過RNAi和過表達等技術探究了Pmβ4和傷口愈合關鍵基因(過氧化氫基因catalase和超氧化物歧化酶基因superoxide dismutase)的關聯關系。通過制備組織切片進一步明確了Pmβ4對于傷口愈合的影響。初步揭示了斑節對蝦Pmβ4在先天免疫和傷口愈合中的作用機制,為對蝦養殖過程中出現的病原感染和防治,及創傷修復等問題的解決提供理論支持。(1)在轉錄組中獲得Pmβ4 c DNA序列全長。開放閱讀框有501 bp,編碼166個氨基酸。預測蛋白分子量18714.05 D,等電點5.75。多重序列比對和進化樹結果顯示,斑節對蝦Pmβ4與其他對蝦胸腺素β4相似性較高且聚為...

【文章頁數】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 文獻綜述
        1.1.1 斑節對蝦的簡介
        1.1.2 胸腺素β4的功能及研究現狀
            1.1.2.1 炎癥反應
            1.1.2.2 傷口愈合
            1.1.2.3 內皮細胞再生及血管生成
            1.1.2.4 腫瘤發生與轉移
    1.2 本研究的目的和意義
第二章 斑節對蝦胸腺素β4基因的克隆和序列分析
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 實驗器材
        2.2.3 實驗試劑與配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 實驗用品準備
        2.3.2 總RNA提取
        2.3.3 cDNA第一鏈的合成
        2.3.4 Pmβ4 全長cDNA克隆
            2.3.4.1 Pmβ4基因的引物設計
            2.3.4.2 驗證Pmβ4基因的開放閱讀框
            2.3.4.3 膠回收PCR目標產物
            2.3.4.4 連接與轉化
            2.3.4.5 挑取單克隆與菌液PCR
            2.3.4.6 RACE克隆Pmβ4 3’非編碼區
        2.3.5 Pmβ4的生物信息學分析與進化樹構建
        2.3.6 Pmβ4的定量表達分析
    2.4 實驗結果
        2.4.1 Pmβ4序列與生物信息學分析
        2.4.2 Pmβ4的多重序列比對與進化樹分析
        2.4.3 Pmβ4的組織表達模式
    2.5 討論
第三章 斑節對蝦胸腺素β4的抗菌作用分析
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗動物及菌株
        3.2.2 實驗器材
        3.2.3 實驗試劑與配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 RNA干擾實驗
            3.3.1.1 重組載體pD7-β4和pD7-GFP的構建
            3.3.1.2 體外轉錄模板的制備
            3.3.1.3 雙鏈RNA的體外轉錄
            3.3.1.4 雙鏈RNA的純化
        3.3.2 原核表達載體的構建
            3.3.2.1 pET-32a-Pmβ4 重組質粒誘導表達條件的優化
            3.3.2.2 蛋白SDS-PAGE電泳分析
            3.3.2.3 蛋白免疫印跡Western Blotting
            3.3.2.4 Pmβ4重組蛋白破碎、純化及透析
            3.3.2.5 Pmβ4重組蛋白濃度測定
        3.3.3 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測Pmβ4 與細菌間的結合能力
        3.3.4 液體培養基法檢測重組蛋白Pmβ4的體外抗菌能力
        3.3.5 菌刺激下基因Pmβ4的定量表達分析
        3.3.6 副溶血弧菌應激試驗
            3.3.6.1 原位雜交實驗
            3.3.6.2 血淋巴對副溶血弧菌的清除實驗
            3.3.6.3 存活率統計分析
    3.4 實驗結果
        3.4.1 Pmβ4重組蛋白的原核表達
            3.4.1.1 Pmβ4最優原核表達條件
            3.4.1.2 Pmβ4的純化與蛋白印跡
        3.4.2 重組蛋白Pmβ4與細菌間的結合能力
        3.4.3 重組蛋白Pmβ4在液體培養基法中的體外抗菌能力
        3.4.4 菌刺激后Pmβ4相對表達量的變化
        3.4.5 副溶血弧菌應激實驗
            3.4.5.1 熒光定量判斷干擾效果
            3.4.5.2 原位雜交
            3.4.5.3 Pmβ4對血淋巴中副溶血弧菌的清除實驗
            3.4.5.4 存活率統計
    3.5 討論
第四章 斑節對蝦胸腺素β4促進傷口愈合的作用分析
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 實驗器材
        4.2.3 實驗試劑與配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 實驗用品預處理
        4.3.2 總RNA提取
        4.3.3 cDNA的合成
        4.3.4 制造傷口后基因Pmβ4的定量表達分析
        4.3.5 傷口愈合基因的表達測定
            4.3.5.1 定量引物設計
            4.3.5.2 基因定量分析
        4.3.6 組織切片
    4.4 實驗結果
        4.4.1 制造傷口后Pmβ4的表達情況
        4.4.2 制造傷口后過氧化氫基因CAT的表達情況
        4.4.3 制造傷口后超氧化物歧化酶基因SOD的表達情況
        4.4.4 組織切片
    4.5 討論
結論
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3992510