調度自動化論文:

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 　　摘　要：目的：改良成人成骨細胞消化培養方法，以滿足在細胞學水平進行骨代謝性疾病研究的需要。方法：取無菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血細胞和成纖維細胞；骨片經短期培養后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量純凈成骨細胞。細胞長至匯合后生成黑色結節。分別采用NPP底物法、125I標記放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型膠原順序沉淀抽提、SDS－PAGE還原電泳法測定細胞上清中成骨細胞主要特征性分泌物：大量堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原�！〗Y果：黑色結節經四環素染色，熒光顯微鏡下觀察為骨結節特征性的金黃色。成骨細胞上清中AKP分泌量為(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量為(1.875±0.549) ng/ml，明顯高于成纖維細胞(P＜0.01)�？蓹z測到Ⅰ型膠原而無Ⅲ型膠原。結論：此改良方法可以在短期內得到大量性狀穩定成骨細胞，同時避免成纖維細胞混入。
　　 關鍵詞：成骨細胞　堿性磷酸酶　骨鈣素　膠原
　　成骨細胞特征性表型為分泌骨鈣素(OCN)、大量堿性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型膠原’而無Ⅲ型膠原分泌［1］。我們采用改良骨組織消化培養方法，將骨片經短期培養后’再用胰蛋白酶消化’加快骨細胞的釋放。經形態學觀察及特征性分泌物檢測證實’獲得成骨細胞數量多，并與纖維細胞有明顯區別。
　　材料與方法
　　一、液體的配制
　　0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO’Detroit’Michigan)溶解于d-Hank’s液，抽濾滅菌。培養液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL’Grand Island’NY)’加20%滅活新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml。低血清培養液為5%滅活新生牛血清，其余同培養液。使用25 cm2培養瓶(NUNCLON’Denmark)。
　　二、骨組織片消化
　　取骨科手術中獲得的無菌骨碎片’徹底去除骨膜及軟組織；用無菌Hank′s液沖洗3次’剪碎至體積小于1mm3；Hank′s液多次沖洗至骨片發白’放入錐形瓶內’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍體積)’37℃水浴中消化(30 min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培養液中’置37℃ CO2培養箱內2～3 d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30 min’上清液經尼龍網過濾后’離心10 min(1000 r/min)’去掉上清液’沉淀物用培養液打勻’接種于25 cm2培養瓶內’重復3次’直至離心后無沉淀物為止。
　　將消化后的骨片浸泡于培養液中’2～3 d后’重復上述胰蛋白酶消化步驟’仍有細胞釋放’根據所需細胞量’可重復數次。接種后培養瓶內培養液較渾濁’10 h后即有貼壁細胞’72 h后’細胞完全貼壁’可沖洗、換液。此后隔日換液。取第二、三代細胞，消化后，以1×105/ml濃度接種于培養瓶中，每瓶4 ml’5 d后換低血清培養液6 ml，24 h后收集上清液，分裝于5個離心管內，-18℃保存’用于檢測。
　　三、成骨細胞特征性鑒定
　　以皮膚成纖維細胞作為對照，鑒定實驗所得成骨細胞。
　　1.形態學觀察:除常規形態學觀察外，采用趨骨性熒光素標記細胞培養生成結節。細胞培養瓶內加入四環素’使終濃度為50 μg/ml’培養箱內培養1 h’換新鮮培養液培養1 h，經Hank′s液沖洗3次’乙醇梯度脫水’固定’Olympus-Vanox-T顯微鏡落射熒光觀察。
　　2.成骨細胞上清液AKP檢測:采用磷酸對硝基苯酯二鈉鹽(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt’NPP’上海麗珠東風公司)比色法［2］’無色p-NPP與AKP在37℃水浴中反應生成黃色對硝基苯p-Nitrophenol’經405 nm波長比色’測得OD值’換算成國際單位。
　　3.成骨細胞上清液中骨鈣素檢測:采用BGP放免試劑盒(北京東亞免疫技術研究所)檢測［3］。根據放射免疫競爭結合原理，125I標記OCN和樣品所含OCN與OCN抗體競爭結合，使用分離劑使結合抗體沉淀，4℃離心后，γ計數器測定沉淀物cpm數，根據標準品曲線得到樣品OCN含量。
　　4.成骨細胞上清液中膠原抽提及檢測:采用中性、酸性Nacl溶液順序沉淀抽提［4］，SDS-PAGE垂直板還原電泳法［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝膠板固定于垂直板電泳槽［5］。電泳液為0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；樣品液為0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚蘭；染色液為0.25%考馬斯亮藍R250、25%異丙醇和10% HAC；脫色液為5%異丙醇和8%HAC。樣品解凍后’放55℃水浴中變性1 h’加入樣品緩沖液50 μl’每個樣品點2孔’每孔加樣20 μl’另加Ⅰ、Ⅲ型膠原標準品’50 mA恒定電流電泳1 h后’每個樣品第1孔內加入100 μl 20%β巰基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)樣品緩沖液’靜置1 h后’13 mA恒定電流電泳12 h’染色液染色1 h’脫色液脫色24 h’拍照片。
討　論
　　一、成骨細胞體外培養方法的建立
　　早在20世紀60年代’Peck和Birge［8］開始用膠原酶消化骨片’體外培養成骨細胞獲得成功；1975年’Wong等［9］采用多次膠原酶消化’使培養的成骨細胞得到純化。1985年’Robey和Termin等［10］采用低Ca2+培養液培養骨片獲得成骨細胞’經過鑒定’比酶消化法得到的細胞更加純化。本實驗改良上述方法’先使用比膠原酶更便宜的胰蛋白酶進行多次消化’胰蛋白酶僅能消化骨小梁表面細胞周圍的基質，而對于埋藏于骨基質中的大量靜止骨細胞無作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨組織中殘留的血細胞、成纖維細胞、骨髓細胞及部分成骨細胞和骨細胞，因此棄之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，無細胞釋放，證實骨片中僅含有埋藏于基質中的骨細胞，筆耕文化傳播，而無其它細胞。骨片在培養液中浸泡后，靜止骨細胞通過骨小管內細胞縫隙連接［11］’感知外界溶液濃度變化’特別是鈣離子濃度變化［10］’開始活躍起來’通過骨細胞性溶骨作用［12］釋放出來’在骨片周圍形成貼壁細胞’但一般要經過2周以上時間’且貼壁細胞僅出現于骨片周圍［10］’數量有限。在骨細胞釋放出來以前’再次使用胰蛋白酶可大大加速其釋放速度和數量’既代替了膠原酶的作用’又可避免成纖維細胞的混入。消化細胞接種后，經2～3周培養可達匯合’取第2、3代細胞檢測，可避免長期培養，反復傳代后引起細胞分化和表型的改變。本實驗結果顯示，此方法簡單、實用，并可獲得足夠數量的成骨細胞。
電力系統穩態分析論文  

本文編號：7891