【摘要】：從印染廠活性污泥中分離到的一株能高效降解苯胺的細菌菌株AD9,其最高耐受苯胺濃度 為4500mg/l,在18小時內將起始濃度為1000mg/l的苯胺完全降解。經傳統菌株表型比較、16S rDNA序列同源性比對(GenBank登錄號:AY89912)、GC含量測定以及標準菌株DNA-DNA雜 交分析,將該菌鑒定為Delftia tsuruhatensis AD9。采用脈沖場電泳和Southern雜交實驗結果表明, AD9的苯胺降解基因簇位于染色體上。本工作有關Delftia tsuruhatensis的苯胺降解能力以及苯胺 代謝基因簇的染色體定位特征研究屬首次報道。 利用苯胺不完全降解時中間產物的顯色反應如當鄰苯二酚(Catechol)代謝被阻斷時,鄰苯 二酚累積后自身氧化成棕色;和2-羥粘康酸半醛(HMS)代謝被阻斷或鄰苯二酚雙加氧酶過量表 達時,因HMS累積而呈現金黃色,建立了簡便快速的苯胺代謝途徑相關基因的功能篩選方法。 從構建的AD9的基因文庫中篩選得到三個陽性克隆,分別為含9.3kb HindⅢ插入片段的棕色陽 性克隆pDA1、含大小為15.4kb的HindⅢ插入片段的金黃色陽性克隆pDBⅡ和含8.2kb EcoRⅠ 插入片段的金黃色陽性克隆pDB2。Clark-type電極測定重組子pDA1的苯胺雙加氧酶酶活為32±3 mg O_2/(g dry、Wt).h;內源呼吸16±2 mg O_2/(g dry Wt).h。pDA1在含苯胺的LB液體培養基上培養 24小時后,GC/MS分析產物的化學性質:主要的特征離子在m/z 92(M+-H_2O),81(M+-CHO), 64(M+-H_2O,-CO),與鄰苯二酚標準品的結果完全一致。比色法測定重組子pDB2的鄰苯二酚 2,3雙加氧酶(C23O)酶活為3.2 units/mg protein。 對三個陽性克隆pDA1、pDB2和 pDB11進行核苷酸序列分析,經拼接獲得一段大小為24.7kb 的序列(GenBank登錄號AY940090),包含25個開放閱讀框,其中至少含有17個與苯胺代謝有 關的基因,命名為tad QTA1A2BRD1C1D2C2EFGIJKL。基因簇兩側含轉座酶和IS1071序列。調控 基因tadR編碼賴氨酸型調控蛋白。tadQTA1A2B基因簇的表達由一個啟動子控制,編碼多組分的 苯胺雙加氧酶。tadD1C1D2C2EFGIJKL基因簇的表達由一個啟動子控制,編碼參與鄰苯二酚間位 裂解途徑所有的酶系,其中tadD1和tadD2編碼的兩組植物型鐵氧化還原蛋白,tadC1和tadC2 編碼的兩組鄰苯二酚雙加氧酶,功能是催化鄰苯二酚的開環反應。余下的tadEFGIJKL基因簇編 碼2-羥粘康酸半醛脫氫酶(HMSD)、水解酶(HMSH)、2-酮-4-烯戊酸水解酶(OEH)、乙 醛脫氫酶(ADA)、4-羥基-2-酮戊酸醛縮酶(HOA)、4-草酰巴豆酸脫羧酶(OCD)和變構 酶(OCT)。將鄰苯二酚開環所產生的中間代謝產物2-羥粘康酸半醛降解為丙酮酸和乙酰輔酶A。 AD9中苯胺降解基因緊密連鎖成簇,兩側由轉座酶基因(IS1071)序列環繞,具有典型的 基因島(gene island)特征。AD9中苯胺代謝基因簇tad與Pseudomonas putida UCC22質粒編碼 的苯胺代謝基因簇tdn在序列和遺傳組織上有很高的同源性,進化上可能來自同一個祖先。序列 分析表明,tad基因簇是比tad基因簇更古老的基因型。AD9的tad基因簇兩側含有轉座酶和IS1071 序列.有可能以基因島為一個轉座單元在不同微生物屬或種間轉移。在AD9苯胺代謝基因簇中 有5個功能尚不明確的開放閱讀框,在模式菌P.putida UCC22苯胺代謝基因簇中沒有發現,表 明基因島作為一個轉座單元在不同微生物屬或種間轉移的同時,可能還伴隨著基因的轉移或重 排,這也可能是污染環境降解微生物的生物多樣性形成的一個重要原因。 構建了苯胺降解tad基因簇啟動子-lacZ表達載體,β-半乳糖苷酶活性測定結果表明tad基 因簇的表達受苯胺誘導。苯胺雙加氧酶基因拷貝數增加的重組菌AD91在苯胺濃度600mg/l的A15
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而I型基因(carzgeneeluster)幾乎對氯代鄰苯二酚沒有降解能力(Harayama，S，，1992)。己報道在月。ineot占acet:wl瑣i心4、乃uetu.arlSpeciesANA一15及Bu渤oael.arlsp.THZ中克隆到兩套鄰苯二酚1，2一雙加氧酶基因，其結構組成比較見圖1一3所示。BukhrodelariPs.THZ是一株能夠降解2一氯苯甲酸(ZCB)并經過鄰苯二酚代謝途徑的細菌。W七setmblof表明當THZ菌株只利用苯甲酸作為碳源時，鄰苯二酚1，2一雙加氧酶CaAtI和CatAZ都可以檢測到;當THZ菌株只利用ZCB或順，順一粘糠酸作為碳源時，只能檢測到Cat八2的活性。但是，當失活acZt基因簇時，這時可以檢測到CaAtI的活性。研究表明，actl基因簇和acZt基因簇的調控因子對誘導物的不同識別導致了CatAI或者CatAZ的形成，CaAtI的誘導物是苯甲酸而不是ZCB

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本文編號：2606889