第一章 文獻綜述

1.1 類胡蘿卜素的種類及其功能特性
類胡蘿卜素是一類由植物和某些光合微生物產生的呈紅色、橘黃色或者黃色的親脂性異戊二烯類染料，一般在 300~600nm 之間有吸收峰。類胡蘿卜素廣泛存在于食物中，如蔬菜、水果和海鮮類等（Polyakov and Kispert 2015）。在自然狀態下，類胡蘿卜素的典型結構特點是高度不飽和，其最顯著特征為含有 3~15 個共軛雙鍵（Raisig andSandmann 2001），共軛雙鍵存在的位置決定類胡蘿卜素的各種理化性質。
1.1.1 類胡蘿卜素種類

在自然界中已鑒定出天然類胡蘿卜素的種類超過 700 種，其中典型的類胡蘿卜素種類如圖 1-1 所示。由于其種類很多，所以分類方法也有多種。若類胡蘿卜素按長鏈 C 原子數量分類可分為：C30、C40、C50三大類，其中絕大部分類胡蘿卜素是 C40類，而在甲基桿菌和葡萄球菌等細菌中會產生一些 C30類（劉曉瑞 2013）。若類胡蘿卜素按長直鏈含有六元環的數目分類可分為：番茄紅素類的直鏈類、β-阿樸-8'-胡蘿卜醛類的單環類以及 β-胡蘿卜素類的雙環類胡蘿卜素。如按照構成元素可分為兩大類：一類是由 C、H 兩種元素組成的環狀或非環狀結構的化合物，將其稱為胡蘿卜素類，這類化合物極性較小，典型代表為 β-胡蘿卜素和番茄紅素；一類是由 C、H、O 三大元素構成的化合物，稱之為含氧類胡蘿卜素，分子中含有氧原子，可形成羥基、甲氧基、羰基和環氧化物等（孫玉敬等 2012），極性較大，典型代表為葉黃素類（劉曉瑞 2013；Britton 1995）。圖1-1 所示的類胡蘿卜素中，β-胡蘿卜素、番茄紅素屬于胡蘿卜素，而 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛、玉米黃質、角黃質和蝦青素屬于含氧類胡蘿卜素；番茄紅素屬于直鏈，β-阿樸-8'-胡蘿卜醛屬于單環，而 β-胡蘿卜素、玉米黃質、角黃質和蝦青素屬于雙環類胡蘿卜素。

1.1.2 功能特性
1.1.2.1 光吸收和光保護作用
在光合生物中類胡蘿卜素是不可或缺的組分，有光吸收和光保護兩方面的作用。類胡蘿卜素可捕獲可見光，然后將自身吸收的光能轉化為電能，傳遞給葉綠素來增加光合效率（Cogdell and Thornber 1980），即為光吸收作用；類胡蘿卜素以熱的形式釋放出單線態氧（高度活性）中的能量，從而使其變成基態氧，對光合生物有必不可少的保護作用（張巖巖和陳玉超 2009）。
1.1.2.2 細胞膜的抗氧化保護劑

在一些嗜極微生物中，類胡蘿卜素多數位于細胞膜上，是組成膜結構的主要成分。經研究，類胡蘿卜素各自特有的結構特征決定了其在細胞膜上的定位。只由 C、H 兩元素構成的胡蘿卜素類如 β-胡蘿卜素和番茄紅素等可完全進入細胞膜內部，同時具有流動性；而含氧類胡蘿卜素由于其含有極性較大的取代基如羥基，可較大程度地影響類胡蘿卜素在膜上的定位。不同的類胡蘿卜素可與細胞膜結構上不同區域的基團起反應而作為細胞膜抗氧化保護劑，其中胡蘿卜素類分子只與細胞膜的內部疏水層上的分子產生有效的反應；而含氧類胡蘿卜素如玉米黃質，由于其極性較大，可穿入極性區而和水相中存在的自由基團發生反應（Bertram 2004）。

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1.2 類胡蘿卜素裂解產物的種類及功能
類胡蘿卜素除了上述功能外，還可作為一些派生物的重要底物。根據類胡蘿卜素種類和裂解位置的不同，可生成多種衍生物，其在生物體中具有重要的功能，如可作為維生素、植物激素及芳香類化合物等。具體介紹如下：
1.2.1 維生素 A
類維生素 A（視黃醛、視黃醇和視黃酸）是一類重要的類胡蘿卜素裂解產物，由含有一個及以上未被取代的 β-末端基團的 C40類胡蘿卜素或含有 β-末端基團和含異戊二烯鏈足夠長的阿樸類胡蘿卜素（如 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛和 β-阿樸-10'-胡蘿卜醛）在 C15-C15'雙鍵位置斷裂生成的化合物（Hoffmann et al. 2012），如圖 1-2a 和 d（Kloer and Schulz2006）。維生素 A 在脊椎動物及細菌的視循環中有著至關重要的作用，可促進感光蛋白視紫紅質的形成（Grote and O'Malley 2011；Spudich et al. 2000）。在動物領域，其他的類維生素 A 如（3, 4）-二脫氧維生素 A、（3R）-3-OH-維生素 A、（3S）-3-OH-維生素A、（4R）-4-OH-維生素 A 等也可作為視循環中的發色團（Seki et al. 1998）。當類維生素 A 含量不足時，會引發視力障礙、角膜軟化及夜盲癥等疾病（趙珺彥和陳啟和 2009）。
所有的反式視黃醇可氧化為反式視黃酸，從而轉化為 9-順式異構體，這類物質屬于核視黃酸（RAR）和視黃酸 X（RXR）感受器，因此在免疫缺陷病及癌癥治療中有著重要的作用（Abu et al. 2005；Simeone and Tari 2004；Spilianakis et al. 2005）。另外，維生素 A 還可促進食物中鐵元素的吸收，并保持正常的上皮組織形態和功能，使皮膚保持濕潤，避免粗糙、干燥及毛囊角質化（Heinrich et al. 2006）。
1.2.2 染料色素

若類胡蘿卜素裂解產物保留有較多的共軛雙鍵，則這類阿樸-類胡蘿卜素可保有原類胡蘿卜素色素的性質。藏紅花呈現出亮橘紅色的原因主要是（1）C20阿樸-類胡蘿卜素藏花酸可降解生成配糖體（圖 1-2a）；（2）C24阿樸-類胡蘿卜素胭脂素可生成橘紅色的胭脂紅（圖 1-2c）（Bouvier et al. 2003a）。由圖 1-2c 可知，番茄紅素在 C5-C6和 C5'-C6'雙鍵位置同時斷裂是合成色素胭脂素（bixin）的第一步（Bouvier et al. 2003a）。所以從胭脂樹（Bixa orellana）種子中提取得到的胭脂素可廣泛用作食品和化妝品的色素添加劑。

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第二章 巴氏葡萄球菌 TS-82 的特性及其產類胡蘿卜素裂解酶的條件優化

葡萄球菌在自然界中無所不在，其中有些種類如金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌及表皮葡萄球菌等，存在于食品中，可產生腸毒素（Greig et al. 2007）從而引發食物中毒（Rodriguez et al. 1996）。之前大部分研究集中關注于金黃色葡萄球菌的致病性，但是近年來有報道表明其他葡萄球菌屬也會產生致病性（Mounier et al. 2006；Simeoni et al.2008）。所以研究食品源葡萄球菌的致病性是至關重要的。我們課題組在前期研究中發現并分離得到一株可以降解類胡蘿卜素產香的微生物，經鑒定是凝固酶陰性的巴氏葡萄球菌，對其在液體培養基的研究結果表明該細菌產生的類胡蘿卜素降解酶為胞外酶（王樹林 2011）。因此，為了進一步了解該菌產類胡蘿卜素裂解酶的能力，以期應用于果酒釀造及食品加工中，本章主要對該菌的特性進行研究，，并優化篩選出最佳產酶酶活的培養條件。

2.1 材料與方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 菌株
實驗室分離保存的巴氏葡萄球菌菌株 TS-82（GeneBank Accession No. KP171185）。
2.1.1.2 主要試劑和儀器
β-胡蘿卜素標準品（98%），紅霉素（E），阿米卡星（AM），利福平（RIF），萬古霉素（VA），四環素（TET），氨芐青霉素（AMP），甲氧芐啶（TRI），氯霉素（C），甲氧西林（ME）：Sigma-Aldrich；0.1%（w/v）結晶紫，新鮮羊血瓊脂培養基，胰蛋白胨大豆瓊脂培養基，甲苯胺藍-DNA 酶瓊脂培養基，Baird-Parker 培養基：Solarbio；其他試劑均為國產分析純試劑。
UV-2000 型紫外-可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；恒溫震蕩培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；HH 恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；pH 計：上海精密科學儀器有限公司；水平層流單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司。
2.1.2 方法
2.1.2.1 培養基及培養條件

完全營養液體培養基：蔗糖 30g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33g/L，酵母浸粉 3g/L，調 pH 至 7.0。固體培養基在液體培養基基礎上添加瓊脂 20g/L。121℃滅菌 20min 備用。在 37℃、130r/min 條件下培養。

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2.2 結果與分析
2.2.1 巴氏葡萄球菌 TS-82 的致病性測試結果
葡萄球菌廣泛分布于自然界中，包括食品及其周圍環境中。葡萄球菌中的很多種，如金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，能引發疾病（Rodriguez et al. 1996）。為了檢測可降解類胡蘿卜素巴氏葡萄球菌 TS-82 是否可安全應用于食品生產中，對其主要毒性因素進行測試，結果如表 2-1 所示。巴氏葡萄球菌 TS-82 在新鮮羊血（5%）平板上培養 24h 后在菌落周圍未發現透明溶血環，表明其為溶血性陰性；TS-82 菌株不能使含有抗凝劑的兔血漿發生凝固，血漿沒有發生改變，表明其為血漿凝固酶陰性；同樣地，TS-82 菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上培養 24h 后未發現光圈，即未產生蛋白水解酶；TS-82 菌株在甲苯胺藍-DNA 酶瓊脂培養基上培養 24h 后未發現甲苯胺藍變色反應，表明該菌株不產生 DNA 水解酶；TS-82 菌株在脂肪酶和卵磷脂酶的測定中未發現有不透明環的出現，表明其為陰性；TS-82 菌株可形成弱生物膜（A590=0.24）。以上結果都顯示 TS-82 菌株未生成與毒素相關的酶，不具備致病性，可安全用于食品加工工業。
2.2.2 巴氏葡萄球菌 TS-82 的耐藥性測試結果
細菌致病性的另一個主要特征是耐藥性。TS-82 菌株在各抗生素的最低抑菌濃度下，37℃培養 24h 后觀察菌體生長情況，發現該菌株只在含四環素培養基上顯著生長，而在其他抗生素培養基上未生長，表明 TS-82 菌株只對四環素（TET）有耐藥性，而對其他的抗生素均敏感（表 2-1）。與之前文獻報道的巴氏葡萄球菌的耐藥性相比（Marino et al.2011），TS-82 的耐藥性明顯低于其他菌株，而且該菌株對甲氧西林和萬古霉素極其敏感，大大提高了該菌株在食品應用上的安全性，為該菌株及所產類胡蘿卜素裂解酶作為生物香氣的新型工具奠定基礎。
2.2.3 培養條件對 TS-82 菌株生長及產酶活性的影響
2.2.3.1 培養時間對 TS-82 菌株生長及產酶活性的影響

如圖 2-1 所示，在接種量 2%、37℃、130r/min 條件下，培養時間對 TS-82 菌株的生長及產酶酶活均有影響。在培養初期，隨著培養時間的增加，菌株呈對數期生長，酶活較低；在 12~16h 時菌株基本進入穩定期，同時酶活也達到最大值；隨著培養時間的延長，菌株 OD 值雖然不再變化，但是大部分菌株逐漸衰亡，產酶量減少，導致酶活下降。因此培養時間選擇 16h。

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第三章 巴氏葡萄球菌 TS-82 類胡蘿卜素裂解酶的分離純化 ······34
3.1 材料與方法 ·························· 34
3.1.1 材料 ···························· 34
第四章 類胡蘿卜素裂解酶酶學特性的研究 ··············45
4.1 材料與方法 ························ 45
4.1.1 材料 ··························· 45
4.1.2 方法 ··························· 45
4.2 結果與分析 ························· 48
第五章 類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物轉化為非香氣物質的條件及鑒定 ··63
5.1 材料與方法 ···························· 63
5.1.1 材料 ······························ 63

5.1.2 方法 ······························ 64

第六章 類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物降解產香氣物質的測定及作用機理的探究

在第五章中提到類胡蘿卜素裂解是生成香氣化合物的重要途徑，如 C13酮類 β-紫羅蘭酮，由于其閾值低至 0.007ppm 而成為風味加工中重要的風味物質（Winterhalter andRouseff 2002），廣泛用于食品加工、飲料飲品制作及化妝品行業中。同時 β-紫羅蘭酮作為 C13類異戊二烯而言還具有一定的生物活性，可抑制癌細胞增殖、調控乳腺癌細胞、抗致畸毒性及降血脂等（孫向榮等 2008；Gurak et al. 2014；Liu et al. 2010）。然而 β-紫羅蘭酮的提取工藝繁瑣、昂貴且量微，所以生物技術手段在這些香氣化合物的形成上備受關注，尤其是酶和微生物的生物催化作用（Shimoni et al. 2003）。因類胡蘿卜素生物轉化生成的香氣化合物是“天然”添加劑而成為生產香氣化合物的重要手段（Uenojo etal. 2007）。類胡蘿卜素的生物轉化可通過非特異性氧化或脂肪氧合酶氧化降解（Wu et al.1999），也可通過過氧化物酶（Zorn et al. 2003b）或類胡蘿卜素裂解氧合酶特異性的催化雙鍵裂解來實現（Schwartz et al. 2001）。類胡蘿卜素裂解酶可催化許多雙環及鏈狀類胡蘿卜素底物在 C9-C10和 C9'-C10'雙鍵位置斷裂產生一分子的 C14雙醛和兩分子衍生的C13酮類（Kloer and Schulz 2006）。由于類胡蘿卜素裂解酶廣泛的底物特異性，所以可生成多種 C13化合物，包括 α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、3-OH-β-紫羅蘭酮、3-O-β-紫羅蘭酮、假紫羅蘭酮和香葉基丙酮等（Ilg et al. 2009）。

在上一章中，通過高效液相色譜及 HPLC-MS 鑒定得到底物裂解生成的非香氣物質。通過非香氣物質的信息初步推斷該胡蘿卜素裂解酶作用于類胡蘿卜素底物的C9-C10/C9'-C10'雙鍵位置。而文獻報道類胡蘿卜素在 C9-C10/C9'-C10'雙鍵位置斷裂可產生C13酮類化合物（Hoffmann et al. 2012），故本章在上一章試驗條件的基礎上，通過 GC-MS手段測定所得純酶催化不同底物裂解生成的香氣物質，并結合生成的香氣物質與非香氣物質來準確探究該類胡蘿卜裂解酶的作用位點，揭示其催化機理。

6.1 材料與方法
6.1.1 材料
6.1.1.1 類胡蘿卜素裂解酶純酶的制備
參照 4.1.1.1 的方法制備純酶粉，4℃保存待用。
6.1.1.2 試劑、儀器

β-紫羅蘭酮，β-環檸檬醛購自 Acros-Organics（美國）；β-阿樸-8'-胡蘿卜醛（98%）、β-胡蘿卜素（98%）、玉米黃質（95%）、角黃質（95%）、蝦青素（95%）購自 Sigma-Aldrich第七章 結論、創新點與展望7.1 結論（美國）；內標 3-辛醇購自北京百靈威試劑有限公司；丙酮購自隴南化學試劑公司；其他分析級試劑購自天津科密歐。

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第七章 結論、創新點與展望

7.1 結論
類胡蘿卜素裂解酶是一類對類胡蘿卜素具有催化作用，可將底物轉為目標產物的生物酶類，因具有降解效率高、專一性強、催化條件溫和、產物中目標產物含量高的特點而受到廣泛關注。類胡蘿卜素裂解酶不僅存在于植物、昆蟲、哺乳類動物中，也存在于部分微生物中，如真菌、變形細菌和光合細菌等。然而，目前有關葡萄球菌及其所產類胡蘿卜素裂解酶的研究甚少。本課題組在沙棘酒前期發酵過程中，分離得到一株高效降解類胡蘿卜素的微生物 TS-82，經鑒定為巴氏葡萄球菌。為完善類胡蘿卜素的降解途徑、開發巴氏葡萄球菌 TS-82 的新功能、揭示類胡蘿卜素裂解酶的催化機理，論文以高效降解類胡蘿卜素的 S.pasteuri TS-82 為對象，研究其致病性，優化培養條件；分離純化類胡蘿卜素裂解酶；利用五種底物對所產類胡蘿卜素裂解酶的酶學特性進行了深入、系統的研究；對類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成的產物進行鑒定，推斷其作用位點。獲得以下主要結論：
（1）巴氏葡萄球菌 TS-82 的致病性及培養條件的優化。對巴氏葡萄球菌 TS-82 進行毒力因子及藥敏試驗得到，該菌不具備致病性，可用于食品加工生產。對菌株 TS-82的培養條件進行優化，得到最適培養基為：蔗糖 41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33g/L，酵母浸粉 3.7g/L，調 pH 至 7.0；培養條件為溫度 36℃，接種量 2%，培養時間 16h，在此條件下可提高所產類胡蘿卜素裂解酶的酶活。
（2）類胡蘿卜素裂解酶的分離純化。上述巴氏葡萄球菌 TS-82 所產類胡蘿卜素裂解酶經 Mono Q 10/100 GL 強陰離子柱、高效制備液相和 Superdex Peptide 10/300 GL 多肽分子篩分離后，可得類胡蘿卜素裂解酶純酶；該酶降解 β-胡蘿卜素的比活力為 125U/g，純化倍數為 446，回收率為 2.39%。經高效液相色譜（HPLC）分析，確定該酶為單一峰，純度達到 95%以上。純化后的類胡蘿卜素裂解酶經 LC-ESI/MS 測定，得其分子量為655.093Da。

（3）酶學特性研究。關于底物特異性，以柱層析純化后的酶為研究對象，研究結果表明所得純酶可催化降解 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質、角黃質和蝦青素，未檢測到其體外催化番茄紅素的活性。根據 Lineweaver-Burk 法作圖求得的 Km值和最大反應速率 Vmax可知，該酶與五種底物親和力大小排列為：玉米黃質>蝦青素>β-胡蘿卜素>角黃質>β-阿樸-8'-胡蘿卜醛，底物轉化率為：玉米黃質>角黃質>蝦青素>β-胡蘿卜素>β-阿樸-8'-胡蘿卜醛。關于酶學特性，該酶對 C40類胡蘿卜素底物的最適溫度為 60℃，而作用于 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛的最適溫度是 50℃，該酶的穩定溫度為 50℃以下；該酶對文中考察底物的最適 pH 為 3.0；Al3+和 Fe3+是該酶的強效催化劑，Fe2+是該酶的強效抑制劑，在 1mM 的情況下就可使該酶幾乎完全失活；H2O2在低濃度范圍內（0~16mM）可促進酶活；低濃度乙醇（0~16%）的添加對酶活影響不大，無抑制作用。

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參考文獻（略）

本文編號：44071