【摘要】 研究背景：水中尸體是法醫學尸體檢驗中常見的類型。我國水網密集,水中尸體檢驗檢驗量很大,每年僅在廣州地區發現的水中尸體就近千具。在水中發現的尸體絕大多數屬于意外溺水死亡,但也可能為自殺或他殺,也不排除死后拋尸入水偽造意外溺水身亡。判斷溺死或是死后入水是案件定性的關鍵。溺死的機制是大腦不可逆的缺氧,由于大量溺液被吸入到呼吸道及肺泡,阻礙氣體交換,導致低氧血癥和二氧化碳潴留,發生窒息死亡。對于新鮮的水中尸體,可以通過案情及口鼻部蕈樣泡沫、水性肺氣腫、呼吸道內泥沙等溺死的典型征象進行溺死鑒定。珠江水域地處亞熱帶氣候,天氣炎熱,根據統計,87%的水中尸體在發現的時候已經高度腐敗,對于水中高度腐敗尸體的死因診斷,由于各種溺死征象已不復存在而成為世界公認的法醫學難題之一。硅藻是一種單細胞藻類,全世界約有16000多種,體長一般在1μm至200μm之間,其最明顯的特征是細胞壁除個別種類外,均高度硅質化,形成上、下兩個透明的殼,以殼環帶套合形成一個硅質細胞壁。硅藻的生活環境非常廣泛,地球上凡是有水滯留的地方,幾乎都能見到硅藻的蹤跡。硅藻細胞壁因為抵抗力強而不易被破壞,硅質含量高者,即使用濃硫酸、濃硝酸煮沸甚至高溫燒灼也難以破壞。尸體腐敗時對檢材組織進行消化處理也能保持其原形,這一特征非常有利于溺死診斷。自Revenstorf在1904年從肺切面液體中直接觀察到硅藻后,國內外法醫學工作者對硅藻檢驗進行了廣泛的研究,在尸體內臟組織(肝、腎、骨髓)中檢出硅藻被認為是明確溺死最有力的指標。通過硅藻檢驗對硅藻進行定性定量分析,不僅可以直接判斷死因,而且對尸體和溺死可疑地點的水樣種類及數量比對分析,還有助于推斷溺死地點。目前法醫學硅藻檢驗的方法很多,其主要包括樣本提取及消解方法、硅藻富集方法、硅藻觀察方法三個基本步驟,近百年來,硅藻檢驗診斷溺死研究,集中在這三個環節,其中樣本提取及消解是法醫學硅藻檢驗成功與否的首要環節和重要步驟。樣本提取及消解方法1937年,Kasparek首先采用濃硝酸消解肺組織,奠定了強酸消解法的基礎。在以后的法醫學實踐中,又發展了硝酸沙浴法、硝酸硫酸法、硝酸硫酸加過氧化氫法、硫酸加硫酸銅法和硝酸乙醇法等。但強酸消解法消解組織過程中存在工作強度高；消解時間長；反應過程劇烈,存在硝酸噴出灼傷人體的危險,所釋放的二氧化氮污染環境；部分硅藻在消解過程中被破壞等缺點。Hiroshi等采用Soluene-350(助溶劑)消化組織,該法較強酸消解法節省時間,工作簡單,但消化能力差,試劑來源也困難,基本不適合在法醫實踐中的應用。此外,還有酶消解法、微波消解法及硅膠梯度法等,但這些方法均存在消解時間長、消化能力差、消解組織量少等缺點。硅藻的富集方法離心是目前全世界法醫學實驗室普遍采用的硅藻富集方法。我國的人體組織器官硅藻硝酸破機法檢驗標準中采用4000r/min離心15min,用吸管吸去上清液,再加重蒸水平衡后離心,重復上述步驟直至上清液酸堿度在6.5-7.5間。本項目課題組趙建等研究發現4000r/min離心15min一次硅藻損失在29.94%至49.60%之間,大量的硅藻存在于被棄去的上清液中。硅藻的觀察方法目前國內外法醫學實驗室絕大多數采用光學顯微鏡檢測臟器組織內的硅藻,一些微型硅藻容易被漏檢或受放大倍數限制無法根據硅藻表面紋飾鑒別其種屬。另外,有學者認為,文獻中不同研究人員報道的硅藻檢驗數據相差較大,可能因為所采用的光學顯微鏡放大倍數不同。因此光學顯微鏡檢測法的準確性,尤其是分類的準確性有待進一步考證。Torre等和Pachar等相繼報道了采用傳統強酸消解與掃描電鏡檢測的硅藻檢驗方法,與光學顯微鏡相比,掃描電鏡具有放大倍數高及景深大的優勢,可觀察硅藻的細微結構,而且容易實現圖像存儲,便于硅藻學家根據硅藻圖像準確鑒定種屬。由于現有硅藻檢驗方法的種種限制,造成硅藻檢驗在法醫學水中尸體死因鑒定中不能完全發揮其應有的作用。而且由于硅藻檢驗缺乏統一規范的標準,爭議較多,檢材常涉及腐敗組織,檢驗難度大,陽性率低,其次樣品處理過程復雜,容易污染,操作環境惡劣,對操作者健康有害,法醫學工作者一直在探討快速、有效、準確,易于推廣的新方法、新技術的研究。目的：1、建立準確、高效的硅藻檢驗技術；2、建立廣東省珠江水域的硅藻掃描電鏡圖譜庫,為廣東法醫工作者進行硅藻種類識別和落水地點推斷提供科學的比對參考依據。1.季節影響.種類方法：(一)勒福特王水消解法的建立1、22只新西蘭大白兔隨機分為動物隨機分為勒福特王水消解組10只,傳統強酸消解組10只,空白對照組2只。取干凈的剪刀剪取約2g腎組織,放入1OOml燒杯中剪碎。2、加入15ml濃硝酸和5ml濃鹽酸；2ml過氧化氫以1滴/3秒的速度逐漸滴入燒杯中；然后靜置15Mmin；3、將樣本放入85℃水浴鍋中加熱50min(加熱過程中同樣以1滴/3秒的速度加入3ml過氧化氫溶液)；4、傳統強酸消解法步驟：1)加入2ml水樣；2)向燒杯中加入20m1分析純濃硝酸和5ml過氧化氫；3)將樣本放入85℃水浴鍋中加熱50min。5、真空抽濾,掃描電鏡觀察；6、比較兩種方法的硅藻回收率、硅藻破壞和消解能力,并采用SPSS17.0進行統計學分析,計量資料采用兩獨立樣本t檢驗分析、計數資料采用卡方檢驗分析,P<0.05為有統計學意義。(二)勒福特王水消解法檢驗動物器官硅藻1、44只新西蘭大白兔隨機分為生前入水組20只(勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法：10只；傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法：10只),死后入水組20只(勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法：10只；傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法：10只),陸地死亡組(對照組)4只。2、動物模型建立：溺死動物模型(將兔籠中沉入水下0.5m,1min后提出水面,30s后重新沉入相同水深處,重復以上步驟直至大白兔死亡,死后在水中浸泡30min)。死后入水組動物模型(采用耳緣靜脈空氣栓塞法,將死亡的兔子置于相同水域相同深度浸泡30min)。陸地死亡組動物模型(采用耳緣靜脈空氣栓塞法)。3、分別對實驗組和對照組進行實驗兔的肝臟、肺臟和腎臟進行檢驗,比較消解時間、檢出率、檢出數量和觀察效果,并應用SPSS17.0進行統計學分析。(三)勒福特王水消解法檢驗水樣硅藻1、對廣東珠江流域19個采樣點在2012年6月進行采樣,其中包括肇慶市德慶縣段等西江支流6個采樣點,湞江樂昌縣段等北江支流9個采樣點以及龍川縣段等東江支流4個采樣點,其中部分采樣點于2012年9月在同樣地點也采集了水樣。2、勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法檢測水樣中的硅藻,收集不同種類的硅藻,并將其適當倍數的電鏡圖像制作成圖譜。結果：1、勒福特王水消解法消解腎組織后的物質殘留重量為0.00604±0.00310g/2g,傳統強酸消解法消解腎組織后的物質殘留重量為0.00979±0.00204g/2g,兩組數據具有統計學差異(t=-3.072,P<0.01)。2、勒福特王水消解法殘留物質較少,硅藻紋理清晰,背景干凈,極少發現硅藻碎片。3、硅藻回收率：空白對照樣本中未發現硅藻。水樣中的硅藻標準含量為711.2個/ml。勒福特王水消解法的硅藻回收率為71.1±10.3%,傳統強酸消解法的硅藻回收率為66.3±9.0%。兩組數據無統計學差異(t=1.106,P>0.05)。4、勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法分析肺臟、肝臟、腎臟組織中硅藻所用的時間均少于傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法,其分析肺臟、肝臟、腎臟組織所用時間約為傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法的1/4、1/3、1/3。5、勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法和傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法消解肺臟、肝臟、腎臟所用時間為：肺臟<肝臟<腎臟,肺臟組織最容易消解,肝臟組織次之,腎臟組織最難消解。6、陸地死亡組中肺臟、肝臟、腎臟組織均未檢出硅藻。生前入水組中,10例樣本中,勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法均檢出硅藻；傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法10例肺臟組織均檢出,3例肝臟組織、2例腎臟組織未檢出硅藻。兩組數據經卡方檢驗,肝臟組織兩種消解方法檢出率χ2=3.529,腎臟組織兩種消解方法檢出率χ2=2.22,兩例χ2均小于χ20.05,11=3.84,P>0.05,不能認為兩種方法對肝臟(或肺臟)的檢出率有差異。死后入水組中,勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法在3例肺臟組織中檢出硅藻,傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法在1例肺臟組織中檢出硅藻；肝臟、腎臟組織均未檢出。7、生前入水組用勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法檢出肺臟、肝臟、腎臟組織中的硅藻數量均多于傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法,其在肺臟、肝臟、腎臟組織中檢出的硅藻數量約為傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法的10倍、4倍、6倍。死后入水組10例樣本中,用勒福特王水消解-濾膜富集-掃描電鏡觀察法有3例檢出硅藻,數量分別為12個/g、15個/g、13個/g,數量均少于20；傳統強酸消解-離心富集-光學顯微鏡觀察法有1例檢出硅藻,數量為2個/g。8、光學顯微鏡觀察微型硅藻時,以人工方式逐漸移動平臺對視野中的硅藻進行觀察,樣品分析速度慢,硅藻表面紋理不清；掃描電鏡觀察時,具有自動掃描功能,自動拍攝并存儲每個視場圖像,樣品分析速度加快,而且能觀察到硅藻的細微結構。9、廣東省珠江水域肇慶市德慶縣段、肇慶市區江濱路段、佛山市三水區段等19個采樣點共檢出21種硅藻(直鏈藻、卵形藻、小環藻、菱板藻、菱形藻、雙菱藻、針桿藻、冠盤藻、舟形藻、曲殼藻、圓篩藻、短縫藻、橋彎藻、海鏈藻、布紋藻、波緣藻、等片藻、輻節藻、雙壁藻、異極藻和羽紋藻),分別屬于羽紋綱和中心綱。結論：1、勒福特王水消解法在不降低硅藻回收率的前提下,可顯著提高硅藻檢驗的有機質消解能力,減少消化時間,且消解后濾膜背景雜質少,硅藻表面紋理清晰,容易進行硅藻種屬鑒定,具有良好的應用前景。2、建立的特定水體的硅藻掃描電鏡圖譜庫有助于法醫檢驗人員獨立完成硅藻種屬的比對,利用掃描電鏡可獲得臟器和水樣所含硅藻的高分辨掃描電鏡照片,檢驗人員只需進行簡單的形態比較,即可判斷兩者中的硅藻種類是否一致。對于提高法醫硅藻學水平、解決水中尸體溺死診斷難題及落水地點推斷具有巨大幫助。 

前言

目前國內外法醫學采用光學顯微鏡檢測臟器組織內的硅藻。其缺點是，檢測勞動強度大，微型硅藻容易被漏檢或受放大倍數限制無法根據桂藻表面紋飾鑒別其種屬。另外，有學者認為文獻中不同研究人員報道的桂藻檢驗數據相差較大，可能因為所采用的光學顯微鏡放大倍數不同。因此光學顯微鏡檢測法的準確性，尤其是分類的準確性有待進一步考證。由于現有硅藻檢驗方法的種種限制，造成硅藻檢驗在法醫學水中尸體死因鑒定中不能完全發揮其應有的作用。而且由于桂藻檢驗缺乏統一規范的標準，爭議較多，檢材常涉及腐敗組織，檢驗難度大，陽性率低，其次樣品處理過程復雜，容易污染，操作環境惡劣，對操作者健康有害，法醫學工作者一直在探討快速、有效、準確，易于推廣的新方法、新技術的研究。關鍵的問題是文獻中描述的各種生物和細菌采用化學或基因檢驗方法，能否作為溺水明確的溺死證據仍然需要大量實踐驗證，還需要特別與傳統的技術，如桂藻檢測技術做一致性研究，而且部分浮游植物和浮游動物在酸消化的過程中遭到破壞，也會出現假陰性的檢驗結果。事實上，桂藻檢驗仍然被認為是水中尸體死因鑒定的黃金標準”。 各水域的桂藻構成與該水域的理化環境密切相關，不同水域的硅藻構成既有共性，又有差異。通過檢驗水中尸體肺、肝、腎等組織器官的娃藻，與水樣中的硅藻進行對比，可以用來推斷死者的落水位置，，從而為偵査提供方向。本研究除動物實驗研究外，還收集了廣東省珠江主要水系的水樣，調查了廣東省珠江水域的常見硅藻種類及數量，為廣東法醫工作者進行桂藻種類識別和地點推斷提供了科學的比對參考依據。
..........

第一章勒福特王水消解法的建立

1. 材料與方法
將實驗兔固定在固定器中，除去右側耳緣靜脈表面的兔毛，輕拍耳緣靜脈擴張血管，注射適量空氣直至兔子死亡。提取檢材所用的器材必須以蒸饋水和重蒸水各沖洗兩遍后用干凈的塑料袋密封。盛裝檢材必須用干凈的塑料袋或以蒸館水和重蒸水各沖洗兩遍的磨砂廣口瓶。硅藻檢驗過程中使用的所有器械、容器在使用前均必須以超純水各沖洗兩遍。提取的檢材應立即分別裝入容器中密封保存、送檢，不加任何防腐劑；不能立即檢驗的應冰凍保存。注意：上述操作必須在通風櫥中進行；勒福特王水應新鮮配置，不宜儲存；剩余勒福特王水應及時稀釋或中和處理；不要將勒福特王水儲存于封閉容器中或靠近火源。一個娃藻分裂為兩個完整殼面的計為兩個桂藻，桂藻碎片面積超過一半的記為一個娃藻，殼環不計數，在高倍下拍攝不同種類的桂藻高分辨掃描電鏡照片，娃藻種類由珠江水利委員會娃藻研究專家進行鑒定。

 

2.結果
根據桂藻殼的形態特征和有性生殖的模式將桂藻綱分為中心目和羽紋目，其中羽紋目又分為無殼縫亞目和有殼縫亞目。廣東省珠江水域肇慶市德慶縣段、肇慶市區江濱路段、佛山市三水區段等19個采樣點共檢出21種桂藻（分類至屬），筆耕文化傳播，分別屬于羽紋綱和中心綱，如下：植物體為單細胞，少數連成帶狀的群體；殼面長捕圓形、狹披針形、舟形，末端頭狀，純圓形或樣狀；中軸區狹，殼縫直，極節很細，中央區増厚并擴展到殼面兩側，增厚的中央區無花紋，稱福節殼縫兩側具橫線紋或點紋，略呈放射狀的平行排列，轄節和中軸區將殼面花紋分成四個部分；具間生帶，但無真的隔片，具或不具假隔片。如圖3-7所示。

第二章勒福特王水消解法檢驗動物器官硅藻.......29
1. 材料與方法.....29
2. 結果........37
第三章勒福特王水消解法調查珠江水域硅藻種類........44
1. 材料與方法.......44
2. 結果.......25
全文小結..........82

全文小結

本研究利用勒福特王水濃硝酸：濃鹽酸=3：1進行桂藻檢驗中有機質的消解，摸索最優實驗條件，并與傳統的硝酸破機法進行比較兩者的消解能力、桂藻破壞和桂藻回收率，應用SPSS17.0進行統計學分析，采用檢驗分析結果。通過溺死動物實驗，對肺、肝和腎組織中的桂藻進行檢驗，分別應用勒福特王水消解濾膜富集掃描電鏡觀察法和傳統強酸消解離心富集光學顯微鏡觀察法，對兩種方法所用消化時間、檢出率、檢出數量以及觀察方法進行比較，應用進行統計學分析，根據數據類型選取分析方法。本研究收集了廣東省珠江水域19取水點的水樣，采用勒福特王水進行消解，并應用掃描電鏡進行分析，建立廣東省珠江水域的桂藻掃描電鏡圖譜庫，為落水地點的推斷提供基礎數據。首次建立勒福特王水消解法：對傳統桂藻檢驗方法中的組織消解體系（濃確酸乙醇或乙魅）進行了改良，建立了基于勒福特王水消解體系的組織消解方法，在不降低硅藻回收率的前提下，可顯著提高桂藻檢驗的有機質消解能力，減少消化時間，且消解后濾膜背景雜質少，桂藻表面紋理清晰，容易進行娃藻種屬鑒定，具有良好的應用前景.
..........

展望

初步研究表明：通過建立的基于圖像處理和模式識別的桂藻鑒定專家系統，可對數據庫內的桂藻進行自動識別，準確率高達90%以上，甚至優于硅藻學專家的人工鑒定結果。國內高亞輝等通過光學顯微鏡掃描系統和提出的基于區域分割方法、閾值分割和數學形態學的處理方法對海洋桂藻自動識別進行了研究，取得了一定進展。近幾年隨著計算機、信息數字化技術的進步，數字化全計算機控制掃描電鏡得到了很快的發展，結關技術的數字化掃描電鏡具有自動獲取圖像、自動搜索顆粒等自動化分析功能，在環境學、材料學、礦物學等研究領域中顯示了良好的應用前景。在法庭科學領域，結合自動化掃描電鏡和能譜分析的射擊殘留物自動分析法被認為是檢驗射擊殘留物最特定的方法，在世界各國司法鑒定中得到了廣泛應用。
.............

參考文獻:

[1] 余政梁,劉超,胡孫林,周玉,趙建,王會品,謝衛兵,王慧君.  PCR-DHPLC法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應用[J]. 中國法醫學雜志. 2013(06)
[2] 李立平,孫婷怡,劉鴻霞,張海東,白英杰,王榮帥,劉良.  北京中心城區水域硅藻的分布[J]. 法醫學雜志. 2012(04)
[3] 張又川,王會品,胡孫林,蘇會芳,趙建,劉超.  浮游生物PCR檢測及其在溺死鑒定中的研究進展[J]. 中國法醫學雜志. 2012(03)
[4] 任賀,張旭,劉國偉,徐曉玲,吳巧雯.  北京周邊水域冬季常見硅藻的初步調查[J]. 刑事技術. 2012(03)
[5] 賴小平,何慶良,林漢光,劉天澤,盧冰楷,傅意玲,邱升元.  東莞溺死案多發河段硅藻種群分布及其法醫學意義[J]. 中國法醫學雜志. 2012(01)
[6] 胡孫林,溫錦鋒,張小婷,方超,王松才,戴維列,劉超.  微波消解-掃描電鏡聯用檢測臟器內硅藻[J]. 中國法醫學雜志. 2010(03)
[7] 劉兆,丁錳,徐少輝.  硅藻檢驗中應注意的新問題[J]. 中國人民公安大學學報(自然科學版). 2009(03)
[8] 汪家文,于曉軍,王曉雁.  溺死法醫學鑒定的研究新進展[J]. 法醫學雜志. 2008(04)
[9] 陳煌,周安居.  498例水中尸體硅藻檢驗分析[J]. 中國法醫學雜志. 2006(S1)
[10] 王恩銀,孟祥志.  4種硅藻檢驗方法的比較研究[J]. 中國法醫學雜志. 2005(05)



本文編號：11592