動物神經干細胞增殖和分化中的自噬作用研究
發布時間：2014-08-13 17:44
第一章 文獻綜述細胞的研究進展
1.1 神經干細胞的研究進展
研究發現，神經干細胞分布在哺乳動物大腦的特殊區域，比如室管膜下區（The Subventricular Zone, SVZ）、海馬區( Hippocampus, HP )等等，這些細胞都具有一致的生物學特性，就是不斷分裂增殖、多分化潛能的特性，它們在不同的誘導條件下可以分化為神經元、星型膠質細胞和突觸膠質細胞。隨著神經干細胞研究的深入，研究者發現，內源性或外源性神經干細胞可能成為神經損傷及神經退行性疾病治療的一種嶄新的治療手段。但在許多疾病狀態下，由于神經干細胞生存微環境的改變，導致神經干細胞之間的信號通路發生改變，這不但影響了神經干細胞分化的可塑性，甚至還可能影響其存活性。
1.2 自噬研究進展
通常，在細胞內部錯誤折疊蛋白及大量冗余的蛋白質主要通過兩種方式進行降解：一種是泛素-蛋白酶體系統，也就是說細胞內的蛋白通過內質網大量積聚后引起細胞內質網應激，從而激活泛素蛋白酶體途徑將多余的細胞通過蛋白酶體途徑消化降解；而另外一種是自噬-溶酶體介導的細胞自噬(autophagy)途徑。自噬（Autophagy），廣泛存在于真核細胞中，是一種基本的生命現象；最早是在1962 年由學者 Ashford 和 Porter 在研究細胞功能時發現細胞存在“自己吃自己”的現象后而提出的。通常所指的細胞自噬是指細胞內部通過自噬途徑降解細胞內的多余的或者錯誤折疊的蛋白以及功能受損傷的細胞器，從而清除細胞內的垃圾并維持細胞內環境的穩定，達到細胞穩定的過程[43]。
目前，研究者主要利用幾種自噬標志性蛋白作為判斷自噬發生活化的標志。LC3及p62蛋白在細胞質內發生點狀積聚說明自噬的發生，是判斷自噬活化公認的金標準。蛋白酶體降解和自噬是處理蛋白的兩個主要機制。與蛋白酶體不同的是，自噬能降解可溶和聚集的蛋白。因此，在自噬過程中，胞漿蛋白-包括細胞器和其他成分-由雙層膜包裹形成自噬體。這些囊泡的成熟包括他們與溶酶體的融合，導致自噬體內容物被溶酶體酶降解。一系列的應激信號，如營養剝奪或用不同抗癌劑（包括誘導ER應激）刺激自噬過程發生-這被認為是細胞必要的反應，參與細胞內一些生理功能。
自噬在細胞內的發生速率是很低的，因此只有在特定的條件下才被激活。暴露細胞于自噬觸發刺激下，啟動一系列自噬結構的形成使IM出現并延伸。哺乳動物細胞內IM確切的來源還不清楚，盡管已被證實可能是新合成的脂類或由ER、Golgi或內體芽生的小泡。跨膜蛋白Atg8和VMP-1對于自噬體的形成是必須的，他們在轉運脂類到IM發揮重要作用，同時募集其它蛋白參與自噬的啟動。因此，Atg8從順式高爾基轉位到自噬起始點似乎是自噬起始階段的關鍵事件。
……………………
第二章 實驗部分...................................23
2.1 大鼠神經干細胞的分離與培...........23
2.1.1 前言..............................23
2.1.2 材料和方法 ......................................24
2.1.3 實驗結果 ........................34
2.1.4 討論......................................40
2.1.5 小結....................................42
2.2 自噬對大鼠神經干細胞增...........................42
2.2.1 前言................................................42
2.2.2 材料和方法 ..........................................44
2.2.3 實驗結果 .........................................50
2.2.4 討論............................60
2.2.5 小結..........................................62
第三章 結 論....................................63
……………………
第二章 實驗部分
2.1 大鼠神經干細胞的分離與培養
神經干細胞（Neural Stem Cells, NSCs）的研究已成為熱點，其研究為治療一些神經退行性疾病和神經系統損傷性疾病帶來了希望，為中樞神經系統（Central Nervous System, CNS）的重建和神經再生提供了一條新的途徑。神經干細胞研究之所以能成為研究熱點之一，源于其重要的發育機制和潛在的臨床應用價值。
雖然神經干細胞的來源有所不同，但是目前關于神經干細胞的分離、培養的技術已經相對成熟，不同實驗室雖然培養方法略有不同，但是整體上沒有太大分別。目前，一般的實驗室利用懸浮培養法在無血清的培養基中分離培養神經干細胞，由于非神經干細胞在這種缺少血清的培養系統中缺乏營養而無法存活，最終只有能夠適應無血清培養基的神經干細胞能夠存活，并且在生長因子的作用下，這些神經干細胞可以進行生長增殖。在這種條件下培養，神經干細胞逐漸形成聚集生長在一起的神經球，經過標志性蛋白染色及 Western Blot 結果顯示，神經球中的多數細胞具備神經干細胞特征。利用胰酶消化、破碎，將成團生長的神經球打碎，就可以獲得分散的神經干細胞。目前，實驗室中培養神經干細胞一般采用的培養基是無血清的 N2B27，同時在培養基中添加堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(mEGF)。
2.2 自噬對大鼠神經干細胞增殖和分化中的影響
自噬（Autophagy），是一種基本的生命現象；自噬最早是在 1962 年由學者 Ashford 和 Porter 在研究細胞功能時發現細胞存在“自己吃自己”的現象后而提出的。通常所指的細胞自噬是指細胞內部通過自噬途徑降解細胞內的多余的或者錯誤折疊的蛋白以及功能受損傷的細胞器，從而清除細胞內的垃圾，維持細胞內環境的穩定，達到細胞穩定的過程[82]。自噬就是指細胞通過某種方式消化降解自身細胞中的部分蛋白或者細胞器，以適應惡劣的環境。研究發現，在饑餓條件下，自噬可以消化降解細胞內多余的或者錯誤折疊的蛋白以及功能受損傷的細胞器，而降解產物再被細胞重新利用，達到維持細胞內環境穩定的作用。自噬在細胞發育、組織重塑、細胞免疫、適應環境等方面發揮著十分重要的作用。
自噬程序活化的最終結果，主要依賴于細胞成分和應激信號誘導的強度和持續時間。因此，除了其在細胞穩態上的作用外，自噬可以是一種細胞程序性死亡方式或發揮細胞保護作用，例如在營養缺乏條件下。并且，自噬在癌癥中發揮雙重作用。一方面，在腫瘤發生的早期起始階段，這一細胞過程可以幫助細胞克服由缺氧和缺營養引起的應激；另一方面，自噬可以發揮腫瘤抑制作用，通過提供最少的 ATP 用于 DNA 修復，避免氧化應激和腫瘤內壞死及局部炎癥。并且，不同抗癌治療激活了腫瘤細胞的自噬，這既可以促進腫瘤細胞死亡，或者成為化療耐受的機制。在神經系統中，自噬具有重要的生理功能：如應對代謝應激，如生長因子損耗，營養匱乏等；作為細胞管家清除有缺陷蛋白或細胞器，阻止異常蛋白聚集體沉淀；而且越來越多的證據表明，自噬在神經損傷及神經退行性疾病中均扮演著重要的角色[45, 46]。而內源性或外源性神經干細胞在這種環境中是否也發生自噬，自噬是否影響神經干細胞的增殖與分化目前還沒有確切的報道。
……………………
第三章 結 論
本研究利用胎鼠大腦皮質細胞懸浮培養成功獲得大鼠神經干細胞，在 EGF、bFGF 缺失的情況下，神經球的生長緩慢，但仍具備神經干細胞的特性，與對照組相比，神經干細胞突起明顯增長，提示神經干細胞向神經細胞分化。進一步的觀察發現，在神經干細胞培養體系中短期撤除 EGF/bFGF 會激活自噬起始基因Beclin1 的表達，同時促進促凋亡相關蛋白 Bax 的表達，抑制抑凋亡蛋白 Bcl-2的表達，促進細胞凋亡發生，影響神經干細胞的增殖和分化，而抑凋亡蛋白 Bcl-2的表達降低，進一步激活了 Beclin1 的活化，誘導自噬的發生，而自噬又影響了干細胞的增殖和分化。本研究表明細胞自噬可能參與大鼠神經干細胞的增殖與分化，為進一步研究中樞神經系統疾病的發病機制和治療手段提供新的線索。
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參考文獻（略）
本文編號：8310
1.1 神經干細胞的研究進展
研究發現，神經干細胞分布在哺乳動物大腦的特殊區域，比如室管膜下區（The Subventricular Zone, SVZ）、海馬區( Hippocampus, HP )等等，這些細胞都具有一致的生物學特性，就是不斷分裂增殖、多分化潛能的特性，它們在不同的誘導條件下可以分化為神經元、星型膠質細胞和突觸膠質細胞。隨著神經干細胞研究的深入，研究者發現，內源性或外源性神經干細胞可能成為神經損傷及神經退行性疾病治療的一種嶄新的治療手段。但在許多疾病狀態下，由于神經干細胞生存微環境的改變，導致神經干細胞之間的信號通路發生改變，這不但影響了神經干細胞分化的可塑性，甚至還可能影響其存活性。
1.2 自噬研究進展
通常，在細胞內部錯誤折疊蛋白及大量冗余的蛋白質主要通過兩種方式進行降解：一種是泛素-蛋白酶體系統，也就是說細胞內的蛋白通過內質網大量積聚后引起細胞內質網應激，從而激活泛素蛋白酶體途徑將多余的細胞通過蛋白酶體途徑消化降解；而另外一種是自噬-溶酶體介導的細胞自噬(autophagy)途徑。自噬（Autophagy），廣泛存在于真核細胞中，是一種基本的生命現象；最早是在1962 年由學者 Ashford 和 Porter 在研究細胞功能時發現細胞存在“自己吃自己”的現象后而提出的。通常所指的細胞自噬是指細胞內部通過自噬途徑降解細胞內的多余的或者錯誤折疊的蛋白以及功能受損傷的細胞器，從而清除細胞內的垃圾并維持細胞內環境的穩定，達到細胞穩定的過程[43]。
目前，研究者主要利用幾種自噬標志性蛋白作為判斷自噬發生活化的標志。LC3及p62蛋白在細胞質內發生點狀積聚說明自噬的發生，是判斷自噬活化公認的金標準。蛋白酶體降解和自噬是處理蛋白的兩個主要機制。與蛋白酶體不同的是，自噬能降解可溶和聚集的蛋白。因此，在自噬過程中，胞漿蛋白-包括細胞器和其他成分-由雙層膜包裹形成自噬體。這些囊泡的成熟包括他們與溶酶體的融合，導致自噬體內容物被溶酶體酶降解。一系列的應激信號，如營養剝奪或用不同抗癌劑（包括誘導ER應激）刺激自噬過程發生-這被認為是細胞必要的反應，參與細胞內一些生理功能。
自噬在細胞內的發生速率是很低的，因此只有在特定的條件下才被激活。暴露細胞于自噬觸發刺激下，啟動一系列自噬結構的形成使IM出現并延伸。哺乳動物細胞內IM確切的來源還不清楚，盡管已被證實可能是新合成的脂類或由ER、Golgi或內體芽生的小泡。跨膜蛋白Atg8和VMP-1對于自噬體的形成是必須的，他們在轉運脂類到IM發揮重要作用，同時募集其它蛋白參與自噬的啟動。因此，Atg8從順式高爾基轉位到自噬起始點似乎是自噬起始階段的關鍵事件。
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第二章 實驗部分...................................23
2.1 大鼠神經干細胞的分離與培...........23
2.1.1 前言..............................23
2.1.2 材料和方法 ......................................24
2.1.3 實驗結果 ........................34
2.1.4 討論......................................40
2.1.5 小結....................................42
2.2 自噬對大鼠神經干細胞增...........................42
2.2.1 前言................................................42
2.2.2 材料和方法 ..........................................44
2.2.3 實驗結果 .........................................50
2.2.4 討論............................60
2.2.5 小結..........................................62
第三章 結 論....................................63
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第二章 實驗部分
2.1 大鼠神經干細胞的分離與培養
神經干細胞（Neural Stem Cells, NSCs）的研究已成為熱點，其研究為治療一些神經退行性疾病和神經系統損傷性疾病帶來了希望，為中樞神經系統（Central Nervous System, CNS）的重建和神經再生提供了一條新的途徑。神經干細胞研究之所以能成為研究熱點之一，源于其重要的發育機制和潛在的臨床應用價值。
雖然神經干細胞的來源有所不同，但是目前關于神經干細胞的分離、培養的技術已經相對成熟，不同實驗室雖然培養方法略有不同，但是整體上沒有太大分別。目前，一般的實驗室利用懸浮培養法在無血清的培養基中分離培養神經干細胞，由于非神經干細胞在這種缺少血清的培養系統中缺乏營養而無法存活，最終只有能夠適應無血清培養基的神經干細胞能夠存活，并且在生長因子的作用下，這些神經干細胞可以進行生長增殖。在這種條件下培養，神經干細胞逐漸形成聚集生長在一起的神經球，經過標志性蛋白染色及 Western Blot 結果顯示，神經球中的多數細胞具備神經干細胞特征。利用胰酶消化、破碎，將成團生長的神經球打碎，就可以獲得分散的神經干細胞。目前，實驗室中培養神經干細胞一般采用的培養基是無血清的 N2B27，同時在培養基中添加堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(mEGF)。
2.2 自噬對大鼠神經干細胞增殖和分化中的影響
自噬（Autophagy），是一種基本的生命現象；自噬最早是在 1962 年由學者 Ashford 和 Porter 在研究細胞功能時發現細胞存在“自己吃自己”的現象后而提出的。通常所指的細胞自噬是指細胞內部通過自噬途徑降解細胞內的多余的或者錯誤折疊的蛋白以及功能受損傷的細胞器，從而清除細胞內的垃圾，維持細胞內環境的穩定，達到細胞穩定的過程[82]。自噬就是指細胞通過某種方式消化降解自身細胞中的部分蛋白或者細胞器，以適應惡劣的環境。研究發現，在饑餓條件下，自噬可以消化降解細胞內多余的或者錯誤折疊的蛋白以及功能受損傷的細胞器，而降解產物再被細胞重新利用，達到維持細胞內環境穩定的作用。自噬在細胞發育、組織重塑、細胞免疫、適應環境等方面發揮著十分重要的作用。
自噬程序活化的最終結果，主要依賴于細胞成分和應激信號誘導的強度和持續時間。因此，除了其在細胞穩態上的作用外，自噬可以是一種細胞程序性死亡方式或發揮細胞保護作用，例如在營養缺乏條件下。并且，自噬在癌癥中發揮雙重作用。一方面，在腫瘤發生的早期起始階段，這一細胞過程可以幫助細胞克服由缺氧和缺營養引起的應激；另一方面，自噬可以發揮腫瘤抑制作用，通過提供最少的 ATP 用于 DNA 修復，避免氧化應激和腫瘤內壞死及局部炎癥。并且，不同抗癌治療激活了腫瘤細胞的自噬，這既可以促進腫瘤細胞死亡，或者成為化療耐受的機制。在神經系統中，自噬具有重要的生理功能：如應對代謝應激，如生長因子損耗，營養匱乏等；作為細胞管家清除有缺陷蛋白或細胞器，阻止異常蛋白聚集體沉淀；而且越來越多的證據表明，自噬在神經損傷及神經退行性疾病中均扮演著重要的角色[45, 46]。而內源性或外源性神經干細胞在這種環境中是否也發生自噬，自噬是否影響神經干細胞的增殖與分化目前還沒有確切的報道。
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第三章 結 論
本研究利用胎鼠大腦皮質細胞懸浮培養成功獲得大鼠神經干細胞，在 EGF、bFGF 缺失的情況下，神經球的生長緩慢，但仍具備神經干細胞的特性，與對照組相比，神經干細胞突起明顯增長，提示神經干細胞向神經細胞分化。進一步的觀察發現，在神經干細胞培養體系中短期撤除 EGF/bFGF 會激活自噬起始基因Beclin1 的表達，同時促進促凋亡相關蛋白 Bax 的表達，抑制抑凋亡蛋白 Bcl-2的表達，促進細胞凋亡發生，影響神經干細胞的增殖和分化，而抑凋亡蛋白 Bcl-2的表達降低，進一步激活了 Beclin1 的活化，誘導自噬的發生，而自噬又影響了干細胞的增殖和分化。本研究表明細胞自噬可能參與大鼠神經干細胞的增殖與分化，為進一步研究中樞神經系統疾病的發病機制和治療手段提供新的線索。
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參考文獻（略）
本文編號：8310
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