血小板參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心血管事件的病理進(jìn)程。在治療中，雖然抗血小板治療效果肯定，但是仍有部分患者發(fā)生心肌梗死、猝死等不良事件。因此對于血小板生理病理深入研究就顯得十分必要。近年來，越來越多的研究采用斑馬魚作為平臺，與其他模式生物相比，斑馬魚具有高繁殖力、體外受精、胚胎透明及養(yǎng)殖造價(jià)低等特點(diǎn)，其在心血管領(lǐng)域尤其是血小板研究中的應(yīng)用越來越受到重視。

　　1 斑馬魚的特點(diǎn)斑馬魚(Danio rerio)是屬于輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚屬的一種硬骨魚。Streisinger等首先對斑馬魚成功實(shí)施了體外受精技術(shù)、單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，建立了純合品系，并獲得了第一個(gè)自然突變體——golden。此后斑馬魚就開始作為模式生物應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。斑馬魚具有以下特點(diǎn)：(1)成年魚個(gè)體小，易于飼養(yǎng)。(2)發(fā)育快速、性成熟期短、繁殖力強(qiáng)。(3)胚胎體外發(fā)育，易于觀察和操作。(4)較完善的胚胎和遺傳學(xué)操作技術(shù)。(5)基因組序列的注釋即將完成。(6)品系資源豐富。

　　2 斑馬魚血小板的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與人類血小板不同，筆耕論文，斑馬魚血小板為帶有稀疏細(xì)胞質(zhì)巨大細(xì)胞核的有核細(xì)胞。在光鏡下斑馬魚的血小板與淋巴細(xì)胞的形態(tài)相似，但血小板胞質(zhì)更加致密，通過血小板聚集實(shí)驗(yàn)可以鑒別淋巴細(xì)胞和血小板。電鏡下斑馬魚血小板細(xì)胞表面光滑，染色質(zhì)致密，細(xì)胞質(zhì)中包含大量的囊泡，有些通過小管系統(tǒng)開口于細(xì)胞膜。此外還可觀察到偽足樣突起。

　　3 斑馬魚血小板與人類血小板的相似性盡管斑馬魚血小板與人類血小板在形態(tài)上具有一定差異，但二者在生理功能方面具有相似性，例如血小板的黏附、激活聚集、釋放反應(yīng)等 ]。因此，利用斑馬魚作為模式生物研究血小板的生理病理功能，具有較強(qiáng)的可行性和應(yīng)用前景。

　　3．1 血小板黏附血管內(nèi)膜在一系列外來刺激條件下發(fā)生損傷，血小板通過特定的膜受體結(jié)合到內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)上，從而觸發(fā)血栓的形成，促進(jìn)止血和血管的修復(fù)。在人類，血小板膜表面的黏附蛋白糖蛋白工b—V—IX(GP工b—V—IX)通過血管性血友病因子(vWF)與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。vwF由血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨核細(xì)胞合成和分泌，是一種存在于血漿、內(nèi)皮細(xì)胞表面和血小板a顆粒的糖蛋白。vwF可與膠原及血小板膜GP工b和GPⅡb／IIIa結(jié)合，在血小板黏附與聚集中發(fā)揮重要作用。血小板也可以通過GP1I b／11a與vWF結(jié)合從而黏附到細(xì)胞外基質(zhì)，但這過程僅在血小板活化變形后發(fā)生，使黏附更加牢固。有關(guān)研究在斑馬魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了vwF mRNA 和vwF的存在。斑馬魚數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)斑馬魚血小板表面黏附蛋白的種類與人類血小板保持一致，兩者結(jié)構(gòu)相似性很高。

　　3．2 血小板的激活及聚集血小板與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合后導(dǎo)致血小板激活，繼而釋放活性物質(zhì)如花生四烯酸及血栓素A2(TXA2)等，加速活化進(jìn)程。TXA2是花生四烯酸代謝過程中生成的具有很強(qiáng)生理活性的產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈的血小板聚集作用，能促使血小板聚集形成血栓。血小板活化后，蘊(yùn)含其中的致密顆粒釋放活性物質(zhì)，如二磷酸腺苷、凝血酶等，它們激活并招募循環(huán)血中的靜息血小板，富集于損傷部位，這過程為血小板聚集，此反應(yīng)的發(fā)生與血小板之間的GPⅡb／Ⅲa黏附密切相關(guān)。斑馬魚數(shù)據(jù)庫檢索顯示，在斑馬魚血小板上存在二磷酸腺苷受體。凝血酶活化血小板主要通過一族G蛋白偶連的蛋白酶活化受體(PARs)介導(dǎo)。人類凝血酶受體為PAR1—4，在斑馬魚上經(jīng)證實(shí)也存在PAR1—4。有文獻(xiàn)報(bào)道了27種斑馬魚PAR，例如PAR1家族、PAR2家族等。環(huán)氧酶(COX)是花生四烯酸代謝過程中前列腺素(PGs)合成的限速酶，具有2種結(jié)構(gòu)亞型，即結(jié)構(gòu)型COX一1和誘導(dǎo)型COX一2。斑馬魚擁有COX一1和C0X一2兩種酶，而哺乳動(dòng)物僅擁有COX一1一種酶l1。此外，磷脂酶A2及血栓素A合成酶一1也被發(fā)現(xiàn)存在于斑馬魚體內(nèi)。斑馬魚血小板同樣可以被膠原、二磷酸腺苷、瑞托霉素、花生四烯酸等激活而發(fā)生聚集。總之，斑馬魚血小板與人類血小板激活受體及花生四烯酸代謝相關(guān)酶具有高度相似性。Jagadeeswaran等 利用瑞斯托霉素、膠原、凝血酶、二磷酸腺苷和花生四烯酸刺激斑馬魚全血發(fā)現(xiàn)血液凝固，表明了人類與斑馬魚血小板在激活和聚集方面具有一定的相似性。

　　3．3 血小板的分泌血小板細(xì)胞內(nèi)含有豐富的胞內(nèi)顆粒，包括致密體、a顆粒、溶酶體。致密體中含有ATP、ADP、Ca 、5-羥色胺、磷酸和胍核苷酸。其中，a顆粒含有許多酶及酶的抑制劑，以及部分粘附分子、生長因子、細(xì)胞因子樣蛋白和凝血因子等 。在正常血循環(huán)中血小板處于靜息狀態(tài)，在受到生理或物理刺激因子作用時(shí)，血小板發(fā)生活化伸出偽足并釋放胞內(nèi)顆粒內(nèi)容物，參與生理性止血或病理性血栓形成等。同樣，斑馬魚在血小板分泌的特性和分泌的物質(zhì)方面與人類相比也基本相同。

　　4 利用斑馬魚作為模式生物研究血小板由于斑馬魚和人類血小板的相似性，使得在斑馬魚體內(nèi)研究血小板功能，為探索人類血小板相關(guān)疾病的病理機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。但是由于斑馬魚血小板功能研究起步較晚，目前還處于初級階段，相關(guān)報(bào)道還較少。CD41抗原是一種相對分子質(zhì)量為14 000的糖蛋白，CD41分子是整合素a1Ib鏈，也稱血小板表面GPⅡb，是位于血小板表面的黏附蛋白受體，有文獻(xiàn)報(bào)道，通過顯微注射CD41一GFP質(zhì)粒構(gòu)建CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚，用綠色熒光蛋白標(biāo)記斑馬魚血小板，受精后48 h在斑馬魚幼魚動(dòng)靜脈中出現(xiàn)帶有綠色熒光的血小板，這樣就可以在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下直接觀察血小板l1 。Gregory等 發(fā)展了激光介導(dǎo)血栓形成的方法來評估血小板的止血及凝血功能。這種方法主要是通過將斑馬魚幼魚暴露在FeC1 ，或者利用激光損傷的方法損傷血管壁，構(gòu)建血管閉塞模型，并檢測以下4個(gè)指標(biāo)：從激光損傷到動(dòng)脈閉塞的時(shí)間、從激光損傷到第一個(gè)血小板附著的時(shí)間、從激光損傷到血栓完全溶解所需的時(shí)間、形成血栓的表面積，從而通過衡量這些指標(biāo)來了解血小板功能的變化 ]。上述CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚及斑馬魚血管損傷模型的建立為后續(xù)血小板的研究提供了良好的平臺。此外，基因敲除技術(shù)在斑馬魚研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，同樣在斑馬魚血小板功能研究方面也應(yīng)用廣泛。斑馬魚基因敲除技術(shù)主要是通過將相關(guān)基因的嗎啉基寡核苷酸顯微注射至斑馬魚胚胎內(nèi)，從而達(dá)到目的基因敲除的目的。基因敲除技術(shù)應(yīng)用于斑馬魚使得大規(guī)模篩選血小板功能調(diào)控基因成為可能。Williams等 。 利用斑馬魚血管損傷模型及基因敲除技術(shù)篩選出prkca、prkcb在維持斑馬魚血小板功能方面發(fā)揮重要作用，敲除這些基因后斑馬魚出現(xiàn)出血及血栓表面積減低的表現(xiàn)。Mlckla為肌球蛋白輕鏈激酶的亞型，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，通過斑馬魚卵顯微注射mlckla的嗎啉基寡核苷酸敲除該基因，利用CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚及斑馬魚血管損傷模型評估血小板功能的改變，證明mlckla有助于血小板形狀的變化和血栓形成 。0 Connor等 通過生物信息學(xué)篩選出BA』 B 、LRRC32、DCBLD2、E5AM 、AN TXR2幾種基因可能編碼血小板膜蛋白，利用基因敲除技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述基因的沉默，隨后在CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚上利用激光介導(dǎo)的血管損傷模型評估血小板功能的改變，證實(shí)了BAMBI、LRRC32的促進(jìn)血栓形成作用及DCBLD2、ESAM 的抑制血栓形成作用。通過注射凝血酶基因的嗎啉基寡核苷酸實(shí)現(xiàn)凝血酶基因的敲除，然后分析相關(guān)基因表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)一種phlda3的基因表達(dá)明顯升高 。向成年斑馬魚靜脈內(nèi)注射a1I6的嗎啉基寡核苷酸敲除該基因，證實(shí)a1Ib基因在維持血小板的正常止血功能上具有重要作用，同時(shí)發(fā)展了一種在成年斑馬魚體內(nèi)敲除基因的方法。

　　5 展望由于斑馬魚與人類血小板的高度相似性，未來利用斑馬魚作為平臺，結(jié)合基因誘變、基因敲除、轉(zhuǎn)基因和胚胎學(xué)技術(shù)，廣泛開展血小板功能的研究成為可能。利用CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚以及激光介導(dǎo)的血管損傷技術(shù)，可以大量篩選影響血小板功能的基因。同時(shí)，斑馬魚的高繁殖力、幼魚早期透明等優(yōu)點(diǎn)也將為相關(guān)研究的開展提供便利。隨著斑馬魚實(shí)驗(yàn)技術(shù)越來越成熟，其在血小板研究中的優(yōu)勢將會(huì)更加突出。