研究背景:嚴重燒傷、創傷、高原低氧環境以及其它原因引起的心臟缺氧,都可導致心肌損害。如嚴重燒傷后,由于強烈的應激和有效循環血容量減少,心肌可因局部血流灌注不足而發生缺氧。心臟作為高耗能循環動力器官,心肌易受缺氧影響而出現嚴重損傷,并最終誘發或加重燒傷休克,增加嚴重燒傷病死率。因此,心肌缺氧損害已成為臨床救治嚴重燒傷、創傷等病人不可忽視的問題,闡明缺氧導致的心肌細胞損害及其發生機制具有重要的臨床意義。自噬是進化上保守且依賴于溶酶體系統的細胞內降解途徑,在生理條件下,自噬通過降解細胞內的長壽命蛋白和老化受損細胞器來維持細胞的正常功能。然而,當自噬過程即自噬流受損時,細胞會因降解底物堆積和營養供給障礙而死亡。近期研究顯示,自噬流受損是多種病理因素導致細胞功能障礙甚至死亡的重要途徑。因此,嚴重燒傷、創傷等引起的缺氧可能通過損傷自噬流導致心肌細胞損害,但其具體作用及機制目前尚不清楚。己糖激酶是糖酵解第一步反應的限速酶,在哺乳動物中,己糖激酶以四種亞型存在于不同組織細胞,在心肌細胞中主要是己糖激酶Ⅱ。研究顯示,缺氧可上調己糖激酶Ⅱ的表達水平,并導致小鼠神經細胞損傷。另有研究顯示,在無糖饑餓時,己糖激酶Ⅱ參與大鼠心肌細胞自噬的調控。因此,我們推測,己糖激酶Ⅱ可能介導了缺氧導致的心肌細胞自噬流受損。MTORC1是細胞生長和代謝的關鍵調節因子。在饑餓條件下,其活性可迅速被抑制從而引發自噬,隨后其活性又被自噬產生的營養物質再次激活從而終止自噬。因而,MTORC1是調節自噬的重要“開關”。然而,缺氧條件下,己糖激酶Ⅱ是否通過MTORC1調控心肌細胞自噬流,目前尚無相關報道。因此,本研究提出缺氧條件下己糖激酶Ⅱ通過MTORC1損傷自噬流進而導致心肌細胞損傷的假設,通過體外構建缺氧模型以及調控己糖激酶Ⅱ的活性和表達,明確己糖激酶Ⅱ在缺氧導致小鼠心肌細胞自噬流受損中的作用及其機制。研究方法:取6只1~2 d齡雌雄不限C57BL/6小鼠,分離心臟并培養原代心肌細胞,并取原代細胞進行以下實驗:1.將細胞隨機分為6組,即正常對照3、6、9 h組及缺氧3、6、9 h組。DMEM-F12培養基常規培養48 h后,各正常對照組更換新鮮DMEM-F12培養基后分別培養3、6、9 h,各缺氧組更換無糖無血清培養基后于37℃低氧培養箱(1%氧氣、5%二氧化碳)內分別培養3、6、9 h。蛋白質印跡法檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ的表達情況,CCK-8法檢測細胞活力。2.將細胞隨機分為正常對照組、單純缺氧9 h組和缺氧9 h+2-DG組。常規培養48h后,正常對照組更換新鮮DMEM-F12培養基后培養9 h,單純缺氧9 h組更換無糖無血清培養基,缺氧9 h+2-DG組更換溶有2-DG(物質的量濃度為10 mmol/L)的無糖無血清培養基,2組均缺氧培養9 h。蛋白質印跡法檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62的表達情況,透射電鏡法觀察細胞自噬體/自噬溶酶體情況,CCK-8法檢測細胞活力。3.將細胞隨機分為正常對照組、單純缺氧9 h組、缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1組和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2組。正常對照組和單純缺氧9 h組常規培養48 h,其余兩組分別轉染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常規培養48 h。正常對照組更換新鮮DMEM-F12培養基后培養9 h,其余三組更換無糖無血清培養基后缺氧培養9 h。蛋白質印跡法檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ的表達情況,CCK-8法檢測細胞活力。4.細胞分組及處理同方法1,蛋白質印跡法檢測反映MTORC1活性的磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表達情況;細胞分組及處理同方法2,蛋白質印跡法檢測磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表達情況;細胞分組及處理同方法3,蛋白質印跡法檢測磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表達情況。結果:1.與對應正常對照3、6、9 h組比較,缺氧3、6、9 h組細胞反映自噬流是否通暢的指標LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表達水平均顯著增加,細胞活力顯著降低,己糖激酶Ⅱ表達水平顯著增加。2.與正常對照組比較,單純缺氧9 h組細胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62表達水平明顯增加,自噬體/自噬溶酶體堆積,細胞活力明顯降低;與單純缺氧9 h組比較,缺氧9 h+2-DG組細胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62表達水平明顯減少,自噬體/自噬溶酶體堆積情況明顯改善,細胞活力明顯增加。3.與正常對照組比較,單純缺氧9 h組細胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值與p62、己糖激酶Ⅱ表達水平均顯著增加,細胞活力顯著降低;與單純缺氧9 h組比較,缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1組和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2組細胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值與p62、己糖激酶Ⅱ表達水平均顯著減少,細胞活力顯著增加。4.與對應正常對照組比較,缺氧各組細胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表達水平明顯降低;與單純缺氧9 h組相比,缺氧9 h+2-DG組細胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表達水平明顯增加;與單純缺氧9 h組相比,缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1組和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2組細胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表達水平明顯增加。結論:缺氧后,心肌細胞己糖激酶Ⅱ表達增加,通過抑制MTORC1的活性,引起自噬流受損,最終導致心肌細胞活力下降。抑制己糖激酶Ⅱ的活性或其表達可減輕心肌細胞缺氧損害。該結論為臨床防治嚴重燒傷后缺氧導致的心肌細胞損害提供了新思路,也為創傷、高原低氧環境以及其他原因引起的心肌缺氧損害防治提供了參考。
【學位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R644
【部分圖文】：

陸軍軍醫大學碩士學位論文個指標來判斷自噬流是否通暢[30]。結果顯示，與對應正常對照 3、6、9 h 組比較， 3、6、9 h 組心肌細胞 LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加（n=3； P<0.01），p62 表達水平顯著（n=3；P<0.01），提示缺氧可導致心肌細胞自噬流受損（圖 2-1，A，B 和 C）。

圖 2-1 缺氧對小鼠心肌細胞自噬流的影響 3 h 組，2. 缺氧 3 h 組，3. 正常對照 6 h 組，4. 缺氧 6 小鼠心肌細胞活力的影響表法將原代小鼠心肌細胞分為 6 組，即正常對照 3過 CCK-8 法對各組細胞的活力進行檢測。結果顯示，缺氧 3、6、9 h 組心肌細胞活力均有不同程度下降肌細胞活力下降（圖 2-2）。

陸軍軍醫大學碩士學位論文組及缺氧 3、6、9 h 組。通過蛋白質印跡法檢測各組心肌細胞己糖激酶Ⅱ的表達情況。結果顯示，與對應正常對照 3、6、9 h 組比較，缺氧 3、6、9 h 組心肌細胞己糖激酶Ⅱ的表達水平明顯增加（n=3；P<0.01），提示缺氧可上調小鼠心肌細胞己糖激酶Ⅱ的表達水平（圖 2-3，A 和 B）。
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2 李蕾,施玨,羅堯生,薛元明;己糖激酶Ⅱ基因微衛星多態性與NIDDM的關系[J];云南醫藥;1997年06期

3 羅貴娟;繆明永;;己糖激酶Ⅱ與腫瘤研究進展[J];中華普通外科學文獻(電子版);2013年01期

4 蔡刁龍;朱光輝;翁杰鋒;;缺氧對人胃癌細胞的細胞周期調控及己糖激酶Ⅱ表達的影響研究[J];臨床和實驗醫學雜志;2008年03期

5 任暉;章聯;林曉燕;;小檗堿調節己糖激酶Ⅱ抑制乳腺癌細胞糖酵解的作用研究[J];中國藥師;2017年11期

6 張歡;黃思超;蔡紹暉;;以己糖激酶Ⅱ為靶點治療腫瘤的研究進展[J];華西藥學雜志;2011年03期

7 楊忠東;陳澤龍;游學宇;;TRACElab Fx-_(FDG)制備及影響因素[J];福州總醫院學報;2005年01期

8 張佳;王小麗;于東升;胡巧云;唐傳峰;劉培玉;盛亮;;高糖誘導血管內皮細胞凋亡機制的研究[J];現代生物醫學進展;2018年11期

9 崔曉東;閆紅;任榮;王轉花;;重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑通過下調己糖激酶Ⅱ抑制HepG2細胞生長[J];中國生物化學與分子生物學報;2017年09期

10 項坤三，吳松華，王延慶，鄭泰山，孫多奇，陸惠娟;中國人糖代謝限速酶基因微衛星多態性及與NIDDM的關系[J];中華醫學遺傳學雜志;1995年02期

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1 易若凡;己糖激酶Ⅱ在缺氧小鼠心肌細胞自噬流受損中的作用及機制研究[D];中國人民解放軍陸軍軍醫大學;2019年

本文編號：2842544