在田徑運動中,短跨類項目跨欄運動員跟腱(人體最大的肌腱,以下統稱為肌腱)組織易發生損傷,且恢復慢,嚴重影響運動員的競技成績和運動生涯,目前這成為臨床醫學和運動醫學主要攻克的難點,這種損傷主要有三種機制:撕裂、拉力過載及挫傷。治療肌腱損傷的傳統方法包括物理療法、手術療法、冰凍療法等,但這些療法治療周期長,修復慢且易修復后肌腱生理功能和機械性能下降,易造成再次損傷。國務院在《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006-2020)》中強調指出要全方位大力推進干細胞修復運動損傷組織的相關技術實驗體系;六部委聯合發布《“十三五”健康產業科技創新專項規劃》中明確要求加快干細胞與再生運動醫學的臨床應用。干細胞的自我更新、高倍速增殖能力和多項分化潛能為個體組織發育及損傷組織再修復提供了重要理論和實驗基礎。肌腱干細胞的發現及其生物學特性的研究為肌腱組織病理機制的探究提供了理論基礎,同時為干細胞修復肌腱損傷提供實驗依據。本研究運用文獻資料法、數理統計法、專家訪談法和實驗法等研究方法主要做了體外分離培養鴨胚肌腱干細胞,優化肌腱干細胞最佳培養體系并建立體外擴增培養技術體系,探究了肌腱干細胞的增殖、分化等一系列生物學特性和多項分化潛能,構建了動物肌腱損傷模型并用肌腱干細胞移植修復,探索體內移植后干細胞的遷移和修復作用,得到以下結論:1.使用I型膠原酶、中性蛋白酶和胰酶通過機械分離法分離鴨胚來源的肌腱干細胞,并通過加不同因子的全培養基純化細胞,純化后的細胞能夠在最優培養體系下傳至31代,通過中代次細胞的復蘇與凍存前進行形態學觀察,細胞仍有很強的增值能力;通過免疫組織化學鑒定、流式細胞術和RT-PCR鑒定肌腱干細胞的特異性表面標記物,免疫熒光鑒定顯示細胞對CD44、CD105、Collagen I、Collagen III、Oct4、Tenascin-C都呈陽性;流式細胞術顯示細胞對CD44、CD166、CollagenI、CollagenIII、Tenascin-C陽性率都在90%以上;RT-PCR顯示細胞對CollagenI、CollagenIII、Nucleostemin、CD44、Tenascin-C特異性基因及表面抗原均呈陽性表達,表明分離的細胞為肌腱干細胞并具有干細胞特性;通過克隆能力形成、生長曲線繪制等生物學進行肌腱干細胞鑒定;通過不同誘導體系誘導肌腱干細胞分化成成脂細胞、成骨細胞、成軟骨細胞,誘導后的成脂細胞用油紅O染色呈現紅色脂滴,RT-PCR檢測顯示脂肪細胞特異性分子標記LPL和PPAR-γ呈陽性表達;成骨細胞誘導成功后出現骨細胞團并用用茜素紅染色呈陽性,RT-PCR結果顯示成骨細胞特異性分子標記OPN和Runx2呈陽性表達;用軟骨誘導液進行誘導分化肌腱干細胞并用阿利新藍染色液染色呈現藍染色的酸性糖胺聚糖,表明形成軟骨細胞團,RT-PCR檢測到軟骨細胞特異性基因Sox9和ACAN陽性表達。90%的hESCs分化為其他的細胞類型或者死亡,只有10%能夠保留形成所有細胞類型的能力,就是維持它們所謂的“干性”,以上結果表明體外分離培養的跟腱來源肌腱干細胞具有“干性”特征、自我增值能力和多項誘導分化潛能。2.通過I型膠原酶構建小鼠肌腱組織損傷模型,并取樣制備石蠟和冰凍切片,結果石蠟切片顯示肌腱纖維束嚴重破壞且排列紊亂,用CM-Dil標記過的肌腱干細胞移植到小鼠肌腱損傷部位,肌腱干細胞能夠穩定遷移到損傷組織周圍并增殖分化,不同時間梯度取樣分析組織及血清學相關指標的連續觀察表明:細胞移植治療組損傷肌腱有較好的修復;血清分析與正常組相比,肌腱干細胞移植組CK值有一定程度下降,表明肌腱干細胞可以修復受損的肌腱組織。總之,本實驗研究了跨欄運動員肌腱組織損傷,并在體外分離培養肌腱干細胞,對肌腱干細胞的生物學特性進行了檢測并鑒定,探索了其最佳培養體系。通過對肌腱干細胞進行多項誘導分化潛能實驗證明了肌腱干細胞具有“干性”特征,構建肌腱干細胞修復小鼠肌腱損傷動物模型,為臨床應用基于以干細胞夯實基礎的細胞療法治療肌腱運動損傷和促進肌腱組織再生提供了實驗依據。
【學位單位】：牡丹江師范學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R686.1
【部分圖文】：

P0～P31鴨TDSCs形態（40×）

三種培養體系的細胞倍增時間對比

鴨TDSCs凍存前和復蘇后細胞形態
【參考文獻】

相關博士學位論文 前3條

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相關碩士學位論文 前8條

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本文編號：2875396