目的:百草枯中毒是臨床中最為危險的中毒性疾病之一,致死率可達30-70%,臨床經過痛苦且無特效解毒劑。急性肺損傷是中重度百草枯中毒早期的主要表現,其進展快,并發癥多,可迅速進展為呼吸衰竭及多器官功能障礙而導致死亡。作為除草劑,具有聯吡啶結構的百草枯會阻斷細胞內電子傳遞鏈,原位產生大量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）造成強烈的脂質過氧化,直接破壞細胞膜的完整性從而起到植物殺傷的作用。百草枯中毒時進入人體后在多胺轉運系統作用下濃聚于肺臟,引起急性肺損傷,但對于其具體機制目前還不完全清楚。Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）作為固有免疫系統組成部分,本是發揮著識別病原并激活免疫系統發動免疫殺傷的重要作用,但近年的研究發現其在急性肺損傷的進程中卻起到了推動作用研究顯示。在急性肺損傷過程中,病原體相關分子模式（Pathogen-associated Molecular Patterns,PAMPs）,如革蘭陰性菌膜上的脂多糖（LPS）、細菌和病毒共有的非甲基化DNA（CpG DNA）或內源性非甲基化DNA如線粒體DNA（mitochond...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 ：MyD88基因敲除可減輕百草枯中毒引起的急性肺損傷
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料
        2.2 動物
        2.3 模型構建及動物分組
        2.4 標本的采集及保存
        2.5 血清TNF-α,IL-1β含量測定
        2.6 肺臟濕/干重比值測定
        2.7 肺組織損傷評分方法
        2.8 RealtimeRT-PCR檢測肺組織MyD88,TNF-α及IL-1βmRNA的表達
        2.9 免疫熒光法檢測MyD88及p-p65表達
        2.10 Westernblot法檢測肺組織TLR4、TLR9、MyD88、p-p65的表達
        2.11 統計學分析
    3 結果
        3.1 小鼠肺濕/干重比值及肺組織損傷評分
        3.2 血清TNF-α和IL-1β水平
        3.3 RealtimeRTPCR檢測細肺組織
        3.4 MyD88及p-p65在肺組織中的表達分布
        3.5 Westernblot法檢測小鼠肺組織
    4 討論
    5 結論
第二部分 ：TLR9介導了百草枯中毒導致的急性肺損傷
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料及儀器
        2.2 動物
        2.3 模型構建及動物分組
        2.4 標本的采集及保存
        2.5 血清炎性因子TNF-α和IL-1β含量測定
        2.6 肺組織損傷評分
        2.7 免疫熒光法檢測TLR9及p-p65表達
        2.8 Westernblot法檢測肺組織TLR9、MyD88、p-IRAK4、p-p65的表達
        2.9 細胞培養
        2.10 模型構建及細胞分組
        2.11 AnnexinV-PI雙染法檢測細胞凋亡
        2.12 RealtimeRT-PCR檢測TLR9、TNF-α、IL-1βmRNA
        2.13 ELISA檢測TNF-α、IL-1β水平
        2.14 免疫熒光法檢測TLR9,p-p65表達
    3 結果
        3.1 小鼠肺組織損傷評分
        3.2 血清TNF-α和IL-1β含量
        3.3 TLR9及p-p65在肺組織中的表達分布
        3.4 Westernblot法檢測不同時間點小鼠肺組織
        3.5 細胞活性檢測及實驗處理濃度的選擇
        3.6 細胞凋亡的檢測
        3.7 RealtimeRT-PCR檢測細胞裂解液
        3.8 上清液TNF-α和IL-1β含量測定
        3.9 TLR9及p-p65在A549細胞中的表達
    4 討論
    5 結論
第三部分 ：TLR9經JNK介導了百草枯中毒所引起的急性肺損傷
    1 前言
    2 材料及方法
        2.1 實驗材料
        2.2 動物及模型構建
        2.3 大鼠標本采集及肺濕重/干重比測定
        2.4 大鼠肺組織HE染色及肺損傷評分
        2.5 DHE熒光染色法檢測大鼠肺組織ROS生成
        2.6 細胞培養及模型構建
        2.7 AnnexinV-PI雙染法檢測細胞凋亡
        2.8 ELISA法檢測TNF-α及IL-6水平
        2.9 RT-qPCR法檢測TNF-α及IL-6的mRNA水平
        2.10 Westernblotting檢測蛋白表達
        2.11 EMSA法檢測AP-1與NF-κBp-p65的轉錄因子DNA結合活性
        2.12 TLR9特異性拮抗劑ODN2088干預小鼠后進行百草枯攻毒之后HE評估急性肺損傷程度；Westernblotting檢測肺組織JNK磷酸化水平
        2.13 統計學分析
    3 結果
        3.1 SP干預降低了百草枯中毒大鼠的肺濕重/干重比(W/D)及肺損傷
        3.2 SP干預減弱了百草枯中毒大鼠肺組織中ROS及炎癥因子mRNA水平
        3.3 SP干預降低了百草枯中毒大鼠肺組織中JNK磷酸化水平及AP-1DNA結合活性,但未影響NF-κBp-p65DNA結合活性
        3.4 PQ對A549細胞存活率的影響具有濃度依賴性
        3.5 SP干預減少了百草枯染毒細胞的凋亡率
        3.6 SP干預減弱了百草枯染毒的A549細胞中ROS及炎癥因子mRNA水平
        3.7 SP干預減少了百草枯染毒細胞的p-JNK蛋白、cleavedcaspase-3蛋白水平,并減弱了AP-1及NF-κBp-p65的DNA結合活性
        3.8 SP干預減弱了百草枯染毒細胞上清液及染毒大鼠肺泡灌洗液的炎癥因子水平
        3.9 TLR9抑制劑ODN2088可減少百草枯中毒時JNK的磷酸化激活從而減輕急性肺損傷程度
    4 討論
    5 結論
本研究創新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
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本文編號：4057464