【摘要】：1前言百草枯(Paraquat,PQ),化學名稱1,1'-二甲基-4,4'-聯吡啶陽離子鹽,是一種非選擇性、接觸性的除草劑。在最近幾年,服用PQ自殺或意外中毒的發生率在一些亞洲國家特別是中國呈現增加的趨勢。雖然目前關于PQ中毒的體內或體外相關研究有很多,但是對于PQ誘導肺損傷發病的分子機制還不完全清楚。因此,研究PQ誘導的肺泡上皮細胞損傷的分子機制可以為將來更好的治療PQ中毒提供有用的理論基礎和新的治療靶點。PQ無論是在體內實驗或體外實驗中均表現出誘導細胞凋亡的性質。凋亡所起的作用是通過消除損傷或異常的細胞,進而來維持內環境的穩態。但在很多疾病的發展進程中有異常凋亡的參與。肺泡上皮細胞在PQ中毒早期階段的凋亡增加是其后發生肺損傷和肺間質纖維化的關鍵性事件。PQ通過損傷葉綠體干擾光合作用來對綠色植物發揮毒性作用。PQ通過損傷線粒體來實現對哺乳動物細胞的毒性作用。細胞凋亡的發生可直接由線粒體功能障礙所觸發。與此同時被稱為線粒體自噬的過程即通過溶酶體對損傷的線粒體進行降解的過程也可以對損傷的線粒體進行清除。對受損線粒體的及時清除有助于細胞穩態的恢復,避免進一步的細胞壞死或凋亡。P53在內源性凋亡途徑介導的信號轉導通路中起重要的作用。當細胞受到外界凋亡刺激時,P53的表達增加,P53可通過轉錄依賴途徑調節Bcl-2家族蛋白的表達,也可直接作用于線粒體介導的細胞凋亡。最近也有研究報道P53通過與線粒體自噬通路蛋白Parkin的相互作用抑制Parkin介導的線粒體自噬來干擾損傷線粒體的清除。在本研究中選用人肺上皮樣細胞A549作為研究PQ誘導肺損傷的體外模型,觀察其凋亡過程是否涉及線粒體凋亡途徑與線粒體自噬途徑。進一步探討PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是否起保護作用以及P53抑制劑pifithrin-α(PFT-α)是否能通過減弱線粒體凋亡信號通路的活性與促進PINK1/Parkin介導的線粒體自噬通路,來改善線粒體功能障礙,減少細胞凋亡。2材料與方法2.1實驗材料細胞株:人肺上皮樣細胞A549。2.2實驗分組2.2.1 PQ誘導A549細胞凋亡模型建立與線粒體凋亡途徑相關指標的檢測實驗分組:對照組(等量PBS)、PQ50μM組、PQ100μM組、PQ150μM組、PQ200μM組。各組細胞處理24h、48h后,檢測相關指標。2.2.2 PFT-α通過線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡實驗分組:對照組(0.1%DMSO)、PFT-α(30μM)預處理組、PQ(200μM)組、PFT-α(30μM)+PQ(200μM)組。各組細胞孵育24h后檢測相關指標。2.2.3 PQ誘導A549細胞凋亡過程中線粒體自噬途徑相關指標的檢測實驗分組:對照組(加入等量PBS)、PQ50μM組、PQ100μM組、PQ150μM組、PQ200μM組。各組細胞培養24h后檢測相關指標。2.2.4 PINK1/Parkin通路在PQ誘導的A549細胞凋亡中的作用實驗分組為:對照組(等量PBS)、si RNA組(Parkin siRNA轉染)、PQ(200μM)組、PQ(200μM)+siRNA(Parkin siRNA轉染)組。各組細胞培養24h后檢測相關指標。2.2.5 PFT-α通過線粒體自噬途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡實驗分組:對照組(0.1%DMSO)、PFT-α(30μM)預處理組、PQ(200μM)組、PFT-α(30μM)+PQ(200μM)組。各組細胞孵育24h后檢測相關指標。2.3主要研究方法2.3.1 PQ誘導A549細胞凋亡模型建立與線粒體凋亡途徑相關指標的檢測(1)A549細胞培養并選用不同濃度的PQ處理。(2)MTT法檢測細胞活性。(3)Hoechst 33258染色,熒光顯微鏡觀察細胞核的形態;凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。(4)Rh123染色后,熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位;以及使用流式細胞儀檢測熒光強度。(5)使用Caspases活性檢測試劑盒檢測Caspase-3/-9活性。(6)Western blot檢測Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-XL、β-actin蛋白表達量的變化。2.3.2 PFT-α通過線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡(1)Western blot檢測P53蛋白表達量的變化。(2)使用PFT-α預處理,檢測凋亡率、線粒體膜電位、Caspase-3/-9活性。(3)使用PFT-α預處理,Western blot檢測Bax、Bcl-2、β-actin蛋白表達量的變化。2.3.3 PQ誘導A549細胞凋亡過程中線粒體自噬途徑相關指標的檢測(1)Mito Tracker Green(MTG)與Lyso Tracker Red(LTR)染色,熒光顯微鏡觀察線粒體自噬。(2)Western blot檢測PINK1、Parkin、P62、LC3B、COXIV、β-actin蛋白表達量的變化。2.3.4 PINK1/Parkin通路在PQ誘導的A549細胞凋亡中的作用通過轉染siRNA沉默Parkin基因,Western blot檢測Parkin蛋白的表達情況;進一步檢測在沉默Parkin基因后,PQ對細胞凋亡率與Caspase-3/-9活性的影響。2.3.5 PFT-α通過線粒體自噬途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡使用PFT-α預處理,Western blot檢測PINK1、Parkin、P62、LC3B、COXIV、β-actin蛋白表達量的變化。3結果3.1 PQ誘導A549細胞凋亡模型建立與線粒體凋亡途徑相關指標的檢測(1)PQ對A549細胞具有明顯的細胞毒性,細胞活性和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式降低。(2)Hoechst 33258染色發現PQ引起細胞核的固縮與裂解;細胞的凋亡率和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式升高。(3)通過熒光顯微鏡與流式細胞儀觀察線粒體膜電位的變化,結果均顯示細胞的線粒體膜電位和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式降低。(4)A549細胞Caspase-3與Caspase-9活性和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式增加。(5)Western blot檢測顯示PQ處理后Bax、Bak的表達顯著增加;Bcl-2、Bcl-XL的表達顯著降低。3.2 PFT-α通過線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡(1)Western blot檢測顯示PQ處理后P53的表達顯著增加。(2)PFT-α預處理顯著降低PQ引起的細胞凋亡率與線粒體膜電位的破壞并且抑制了Caspase-3與Caspase-9活性。(3)PFT-α預處理顯著降低Bax/Bcl-2相對蛋白水平比例。3.3 PQ誘導A549細胞凋亡過程中線粒體自噬途徑相關指標的檢測(1)使用MTG和LTR在A549細胞中共染色,然后通過熒光顯微鏡分析顯示PQ處理后線粒體自噬明顯增強。(2)Western blot檢測顯示PQ處理后PINK1、Total Parkin、Mito Parkin、LC3-II/LC3-I的表達顯著增加;P62的表達顯著降低。3.4 PINK1/Parkin通路在PQ誘導的A549細胞凋亡中的作用沉默Parkin基因后,總Parkin蛋白的表達受抑制;通過Parkin特異性siRNA預處理細胞再接受PQ處理與單獨PQ處理相比,前者具有更高的細胞凋亡率并且Caspase-3與Caspase-9活性顯著增加。3.5 PFT-α通過線粒體自噬途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡PFT-α預處理再接受PQ處理A549細胞,線粒體自噬相關蛋白Mito Parkin與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增加。4結論(1)PQ通過激活線粒體凋亡通路誘導A549細胞凋亡。(2)PQ誘導A549細胞凋亡中同時也激活線粒體自噬。(3)PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在PQ誘導的A549細胞損傷中起到直接的保護作用。(4)P53抑制劑PFT-α通過線粒體凋亡途徑與PINK1/Parkin途徑減弱PQ誘導的A549細胞凋亡。
【圖文】：

圖 1 MTT 檢測不同分組細胞活性的改變用 PQ（50，100，150 和 200μM）或 PBS 處理 A549 細胞 24h 或 48h 后，通過 檢測細胞活性。數據以 x±s 表示，獨立重復 3 次：**P <0.01，同一時間點不同濃度與對照組比較；##P<0.01 相同濃度 PQ 組在 48h 與 24h 相比。3.1.2 細胞核形態的改變當細胞發生凋亡時，細胞核會出現固縮或碎裂等凋亡特征的改變。H33258 染色后，通過熒光顯微鏡觀察細胞核的形態，可以將正常細胞與凋區分出來。在本實驗中為了檢查 PQ 處理的 A549 細胞是否伴有形態學變用 Hoechst 33258 染色 PQ 處理的 A549 細胞并通過熒光顯微鏡觀察細胞態。 在 PQ 處理后觀察到 A549 細胞的出現一些凋亡的特征性改變，可清現核固縮和核碎裂（見圖 2）。

圖 4 PQ 導致的 A549 細胞線粒體膜電位的改變用 PQ（50，100，150 和 200μM）或 PBS 處理 A549 細胞 24h 或 48h。Rh 123 染通過熒光顯微鏡觀察與流式細胞術檢測熒光強度來評價線粒體膜電位。圖 A：使用熒光鏡觀察 PQ 對 A549 細胞線粒體膜電位的影響（×400）。圖 B：Rh 123 染色后流式細胞測 A549 細胞線粒體膜電位的變化。圖 C：流式細胞儀檢測結果的統計分析。數據以 示，獨立重復 3 次：**P <0.01，同一時間點不同濃度 PQ 組與對照組比較；##P<0.0濃度 PQ 組在 48h 與 24h 相比。3.1.5 Caspases 檢測試劑盒測定 Caspase-3/-9 活性在細胞凋亡的執行階段，，Caspases 家族在其中扮演著非常重要的角色。體跨膜電勢的降低可使細胞色素 C 從線粒體中釋放至細胞胞質內，從而激酶原形式存在的 Caspase-9。激活的 Caspase-9 可進一步使下游的 Caspase-3 執行細胞的凋亡。本實驗為了進一步研究 PQ 誘導的細胞凋亡，用不同濃度
【學位授予單位】：中國醫科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R595.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 李國強;李國鋒;李玉明;;百草枯中毒的毒代動力學研究進展[J];中華勞動衛生職業病雜志;2014年06期

2 黃英;肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡在急性肺損傷中的作用[J];中國現代醫學雜志;2002年03期

本文編號：2626501