本文選題：ADAMTS-7 + ADAMTS-12　； 參考：《山東大學》2009年博士論文

【摘要】： 金屬蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12同屬于ADAMTS家族(含TSP結構的去整合素金屬蛋白酶,a disintegrin and metalloprotease with thromospondinmotifs,ADAMTS),其對降解軟骨細胞外基質蛋白和關節炎具有非常重要的作用。ADAMTS家族含有分泌性鋅指蛋白,并且有較嚴謹的分子結構,至少包括一個thrombospondin motif重復結構。這個家族具有重要的功能,ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9、ADAMTS-16和ADAMTS-18可以降解多聚蛋白糖,ADAMTS-5在小鼠關節炎模型中蛋白多聚糖的丟失上起著重要的作用。ADAMTS-7和ADAMTS-12具有相同的結構域組成,構成ADAMTS家族的亞型。我們最初報道ADAMTS-7和ADAMTS-12直接結合并降解軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP),一種軟骨最主要的非膠原組成物。另外,我們研究發現α-2-巨球蛋白可以抑制COMP蛋白的降解。最近還有研究發現ADAMTS-12也能夠降解軟骨聚集蛋白多糖。 本文的研究發現,在軟骨分化過程中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達量都顯著增高,意味著在骨骼發育中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達量在時間、空間上都有變化。我們的研究重點關注ADAMTS-7和ADAMTS-12在軟骨分化中的作用,以及涉及到的分子機制。我們研究發現ADAMTS-7和ADAMTS-12蛋白在軟骨分化中被誘導表達。實時熒光定量PCR結果揭示在體外軟骨分化的第5天,這兩種蛋白的表達量還較低,但從第7天開始,他們的量成三倍增長,并在分化后期一直維持此高表達狀態。本文中,我們首次發現ADAMTS-7和ADAMTS-12都能夠抑制軟骨細胞的分化及軟骨成骨。 我們研究發現ADAMTS-7對軟骨細胞的分化及軟骨成骨的抑制功能是依賴于ADAMTS-7的蛋白酶活性的。ADAMTS-7的cysteine-rich結構域對于ADAMTS-7與細胞外基質相互作用和細胞膜表面定位是必不可少的,C-末端的4個thromospondin motif結構域對于ADAMTS-7的蛋白水解酶活性和抑制軟骨細胞分化功能也是必需的。因此,ADAMTS-7對于軟骨細胞分化和軟骨成骨,是一個潛在的負調控因子,這種抑制功能嚴格地依賴于ADAMTS-7的酶切活性。而當ADAMTS-7發生點突變后,則完全喪失了酶切活性,同時也喪失了對軟骨細胞的抑制作用。ADAMTS-7由多個功能性亞基構成,包括一個鋅離子催化結構域和其他幾個非催化結構域,包括:1個disintegrin結構域、1個thrombospondin結構域、1個cysteine-rich結構域(CRD)、1個spacer-1結構域、3個thrombospondin motifs、1個spacer-2結構域和C-末端4個thrombospondin motifs。研究發現C-末端的4個thrombospondin motifs具有結合底物的功能,如結合COMP,而ADAMTS-7的其他功能結構域的生物學功能卻還都不清楚。為了揭示各個結構域的功能,我們構建了一系列的ADAMTS-7的C-末端缺失突變體,發現ADAMTS-7的cysteine-rich結構域對于ADAMTS-7與軟骨細胞外基質相互作用和細胞膜表面定位是必不可少的。然而有趣的是,ADAMTS-7及一系列C-末端缺失突變體蛋白在Cos-7細胞中的檢測結果顯示,cysteine-rich結構域對ADAMTS-7蛋白定位的影響,是有細胞類型特異性的。另外,ADAMTS-7的酶切活性同樣也受到非催化亞基的調控,尤其是C-末端的4個thrombospondinmotifs和抑制性spacer-2結構域。 ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP重要的靶分子,原因如下:(1)PTHrP誘導ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達,(2)在PTHrP基因敲除小鼠的軟骨生長板上幾乎檢測不到ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達,(3)沉默ADAMTS-7/ADAMTS-12或用特異性抗體封閉ADAMTS-7/ADAMTS-12的活性,則幾乎阻斷了PTHrP介導的抑制軟骨細胞肥大化和軟骨成骨的生長。研究發現ADAMTS-7和一個新的軟骨生長因子GEP(Granulin-epithelin precursor)相互作用。骨骺生長板內的軟骨內骨化過程,涉及多個信號傳導途徑。我們的研究證明:1)過表達ADAMTS-7和ADAMTS-12誘導PTHrP,抑制IHH;2)在體外軟骨分化過程中,PTHrP促進ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達:3)在小鼠生長板軟骨細胞中,ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達依賴于PTHrP信號途徑。這些研究結果揭示在軟骨分化過程中,ADAMTS-7、ADAMTS-12和PTHrP信號途徑之間存在一個正反饋通路。另外,ADAMTS-7、ADAMTS-12是PTHrP的下游靶分子,基于以下原因:1)PTHrP抑制軟骨分化過程中Col X的表達,然而當通過特異性干擾RNA抑制ADAMTS-7/ADAMTS-12或用抗ADAMTS-7/ADAMTS-12的抗體封閉后,PTHrP的抑制作用則消失了;再次表達ADAMTS-7/ADAMTS-12,則PTHrP的抑制作用又重新回復:2)ADAMTS-7/ADAMTS-12抗體的封閉,則完全中和了PTHrP所抑制的軟骨細胞肥大化、礦化和骨生長。另外,研究發現PTHrP促進軟骨細胞的增殖,ADAMTS-7發現也具有促進軟骨細胞增殖的功能,而且此促細胞增殖作用主要依賴于C-末端的4個thrombospondin motifs結構域。 另外ADAMTS-7可以作為GEP-轉化酶,抵消GEP刺激誘導的軟骨分化及軟骨內成骨。總之,我們的試驗結果證明,ADAMTS-7是PTHrP信號途徑下游的非常重要的靶分子,負調控軟骨內成骨過程;直接結合、轉化GEP,從而失活軟骨分化生長因子GEP的誘導分化作用。GEP是一種生長因子,參與組織重生、腫瘤形成和炎癥過程。研究發現GEP與彈性蛋白酶結合,被彈性蛋白酶降解。彈性蛋白酶消化GEP的顆粒內連接子,產生微粒多肽;然而分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)直接結合到彈性蛋白酶或抑制顆粒多肽與蛋白酶的結合,繼而封閉彈性蛋白酶的活性。最近研究揭示蛋白酶3也結合并降解GEP;蛋白酶3和彈性蛋白酶都通過降解抗炎癥作用的GEP,從而達到促進嗜中性粒細胞依賴性的致炎癥功能。本文中,我們提供了足夠的試驗證據表明GEP和金屬蛋白酶ADAMTS-7在軟骨細胞內相互作用,ADAMTS-7可以將GEP轉化為小分子片段;另外,GEP能具有促進軟骨細胞分化和軟骨成骨,而ADAMTS-7很可能是通過失活GEP的活性而抑制軟骨分化及軟骨成骨的。我們以往研究發現:1)ADAMTS-7結合并降解COMP,2)COMP和GEP相互作用,促進GEP刺激的軟骨分化功能。結合現在我們的結果ADAMTS-7和GEP相互作用,我們發現ADAMTS-7、GEP和COMP形成一個調節軟骨細胞功能的蛋白質-蛋白質相互作用網。然而ADAMTS-7、生長因子GEP和細胞外基質COMP之間是如何相互作用,如何調控軟骨細胞分化和軟骨成骨的。 本文研究發現ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP調控通路中的新調控因子,同時也可調控軟骨細胞分化和軟骨內成骨。本文對ADAMTS-7、ADAMTS-12負調節軟骨分化的機制進行了初步探討,例如金屬蛋白酶ADAMTS-7和促軟骨分化作用的生長因子GEP相結合,通過轉化GEP成片段從而抑制GEP刺激的軟骨分化作用。另外,本文也為軟骨關節炎疾病提供了潛在的靶分子。
[Abstract]:An important role in the degradation of extracellular matrix proteins and arthritis in mouse arthritis models has been reported . It is also found that the 偽 - 2 - macroglobulin can inhibit the degradation of the COMP protein . In addition , we have found that the 偽 - 2 - macroglobulin can inhibit the degradation of the COMP protein .



In this paper , we found that in the course of the differentiation of cartilage , the expression of TS - 7 and TS - 12 was significantly increased , which means that the expression level of TS - 7 and TS - 12 in cartilage was changed in time and space .



In order to reveal the function of these domains , it has been found that the cysteine - rich domain of the C - terminal is essential for the interaction between the extracellular matrix and the surface of the cell membrane .



PTHrP is an important target molecule for PTHrP . It is shown as follows : ( 1 ) PTHrP induces the expression of TS - 7 and TS - 12 , and ( 3 ) the inhibitory effect of PTHrP on chondrogenic differentiation is dependent on PTHrP signaling pathway .



In conclusion , we have provided sufficient experimental evidence to bind to elastase or inhibit the differentiation of cartilage into bone . In addition , it has been found that GEP is binding to elastase or inhibits the differentiation of cartilage into bone .



In this paper , it is found that the new regulation factors in the PTHrP regulatory pathway can regulate the differentiation of cartilage cells and the formation of bone in cartilage . In this paper , the mechanism of chondrogenic differentiation is discussed in this paper . For example , the mechanism of the chondrodifferentiation is combined with the growth factor GEP , which can inhibit the differentiation of GEP by transforming GEP . In addition , the present paper also provides the potential target molecule for the disease of cartilage .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R341

【共引文獻】

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本文編號：1983385