本文選題：巨噬細(xì)胞 + 免疫　； 參考：《南昌大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 第一部分大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 目的:分離培養(yǎng)并鑒定大鼠脾臟巨噬細(xì)胞。 方法:SD大鼠,腹腔注射水合氯醛麻醉,無(wú)菌取脾臟,制備成脾臟組織細(xì)胞混懸液,裂解脾臟組織細(xì)胞混懸液中的紅細(xì)胞;用RPIM-1640培養(yǎng)基重懸沉淀,接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中,在37℃,50ml·l-1CO2,100%濕度中分別培養(yǎng)1、2、3、6、12、24h,洗滌未貼壁細(xì)胞,相差顯微鏡下分別觀(guān)察脾臟巨噬細(xì)胞的貼壁情況,確定最佳細(xì)胞貼壁時(shí)間。應(yīng)用免疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行細(xì)胞的鑒定;臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力,瑞氏染色鑒定細(xì)胞純度。 結(jié)果: 1.大鼠脾臟組織經(jīng)過(guò)研磨等處理后,得到大量的脾細(xì)胞混懸液,可以滿(mǎn)足進(jìn)一步的分離培養(yǎng)的需要;2.觀(guān)察貼壁細(xì)胞, 1-3h細(xì)胞少量貼壁,12h左右的貼壁細(xì)胞增多, 24h的貼壁細(xì)胞減少。12h是貼壁細(xì)胞合適時(shí)間; 3.相差顯微鏡下觀(guān)察到貼壁培養(yǎng)的脾臟巨噬細(xì)胞多為圓形或橢圓形,少數(shù)呈梭形或多邊形。鏡下觀(guān)察細(xì)胞體積較大,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞核清晰可見(jiàn),胞漿內(nèi)容物豐富;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示貼壁的脾臟巨噬細(xì)胞CD68表達(dá)陽(yáng)性,提示所得的細(xì)胞是脾臟巨噬細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活力95%,瑞氏染色鑒定細(xì)胞純度90%。 結(jié)論:1分離培養(yǎng)出活力和純度符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠脾臟巨噬細(xì)胞;2.貼壁12h是大鼠原代脾臟巨噬細(xì)胞的合適貼壁培養(yǎng)時(shí)間。 第二部分輕度熱應(yīng)激對(duì)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的影響 目的:探討輕度熱應(yīng)激對(duì)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。 方法:以始終處于37℃的大鼠原代脾臟巨噬細(xì)胞作為對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組將大鼠原代脾臟巨噬細(xì)胞置于41℃恒溫箱中,使細(xì)胞輕度熱應(yīng)激1h,然后恢復(fù)到37℃,分成應(yīng)激后0min,30min,60min,120min,180min五個(gè)亞組組,總共六個(gè)組;以吞噬中性紅能力(OD540nm值)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、噻唑藍(lán)法測(cè)定巨噬細(xì)胞對(duì)L1210細(xì)胞的殺傷作用來(lái)反應(yīng)巨噬細(xì)胞的殺傷活性,Transwell小室趨化裝置觀(guān)察巨噬細(xì)胞趨化活性變化;采用雙抗夾心ABC-ELISA法檢測(cè)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞分泌的TNF-a,IL-12濃度的變化。 結(jié)果:輕度熱應(yīng)激(41℃、1h)后,實(shí)驗(yàn)組大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的功能均發(fā)生了變化,而且與應(yīng)激后恢復(fù)時(shí)間有關(guān)。熱應(yīng)激后0min,巨噬細(xì)胞的OD540nm值由正常的0.21±0.01上升到0.34±0.01(p0.05),然后繼續(xù)上升,至60min達(dá)最高值0.81±0.04(p0.01),隨后逐漸下降,應(yīng)激后180min仍然有0.47±0.03(與對(duì)照組比較,p0.05);殺傷活性由正常的35.30±4.37㳠上升到應(yīng)激后0min的45.00±4.74㳠(p0.05),在60min分鐘達(dá)到最大值82.07±5.17㳠(p0.01),隨后逐漸下降,180min后殺傷活性基本恢復(fù)正常,為37.27±5.11㳠(與對(duì)照組比較,p0.05);趨化作用也呈現(xiàn)大致相同的變化趨勢(shì),大鼠脾臟巨噬細(xì)胞正常趨化活性為23.40±5.32/HP;熱應(yīng)激1h后0min為34.60±5.22/HP(p0.05),在60min分鐘達(dá)到最大值60.80±4.02/HP(p0.01)后逐漸下降,180min仍為31.60±4.21/HP(與對(duì)照組比較,p0.05);在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi),大鼠脾臟巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-12均隨著應(yīng)激后時(shí)間的延長(zhǎng)而增多,180min達(dá)到最高(與對(duì)照組比較,P 0.01)。 結(jié)論:輕度熱應(yīng)激后,大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的吞噬功能、殺傷活性、趨化活性都有上調(diào);在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi),大鼠脾臟巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF-α和IL-12在輕度熱應(yīng)激后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。提示輕度熱應(yīng)激對(duì)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的免疫功能有促進(jìn)作用。 第三部分Bip蛋白在輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與意義 目的:探討輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞Bip蛋白的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞功能改變的影響。 方法:原代培養(yǎng)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞,將細(xì)胞置于41℃恒溫箱中,使細(xì)胞輕度熱應(yīng)激,1h后恢復(fù)到37℃,分別檢測(cè)應(yīng)激后0min,30min,60min,120min,180min巨噬細(xì)胞BipmRNA、Bip蛋白的表達(dá);同時(shí)段分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能、殺傷活性和趨化作用。 結(jié)果:(1)輕度熱應(yīng)激后,大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA的表達(dá)明顯增加,30min后到達(dá)高峰,60min、120min時(shí)仍高于對(duì)照組(p0.01),180min后恢復(fù)至正常水平。Bip蛋白的表達(dá)在輕度熱應(yīng)激60min后到達(dá)高峰,120min、180min時(shí)仍高于對(duì)照組(p0.05)。(2)輕度熱應(yīng)激后,大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的吞噬功能、殺傷活性和趨化作用均明顯增強(qiáng),且與BipmRNA、Bip蛋白表達(dá)的改變基本同步。 結(jié)論:輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA、Bip蛋白的表達(dá)與巨噬細(xì)胞功能發(fā)生同步改變,提示Bip蛋白表達(dá)上調(diào)與輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞功能增強(qiáng)可能有關(guān)。 第四部分BiP反義寡核苷酸對(duì)輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的影響 目的:探討B(tài)ip反義寡核苷酸對(duì)體外輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞功能的影響,進(jìn)一步證實(shí)Bip在輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞功能改變中的作用。 方法:設(shè)計(jì)特異性Bip寡核苷酸,反義序列為5’- CTTTGTCCTAGCCGCTCG - 3’;錯(cuò)義序列為5’- CTTTGTCCTAGCCGCTCG - 3’。通過(guò)脂質(zhì)體包裹后將其轉(zhuǎn)染至小鼠脾臟巨噬細(xì)胞,觀(guān)察Bip反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染組、Bip錯(cuò)義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA的改變;然后分別觀(guān)察正常對(duì)照組、輕度熱應(yīng)激組和Bip反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染并輕度熱應(yīng)激后脾臟巨噬細(xì)胞功能的改變。 結(jié)果:Bip反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染大鼠脾臟巨噬細(xì)胞后,與未轉(zhuǎn)染組和錯(cuò)義組比較,輕度熱應(yīng)激后BipmRNA的表達(dá)明顯減少;大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬功能、趨化活性和殺傷活性明顯回落(P0.01)。 結(jié)論:Bip反義寡核苷酸可顯著抑制大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA的表達(dá),并可降低輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬功能、趨化活性和殺傷活性。Bip對(duì)輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的免疫功能有促進(jìn)作用。 第五部分P38MAPK信號(hào)途徑在輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能改變中的作用 目的:研究MAPK信號(hào)途徑在Bip蛋白介導(dǎo)的體外輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能改變中的作用。 方法:P38MAPK抑制劑預(yù)處理大鼠脾臟巨噬細(xì)胞,將細(xì)胞置于41℃恒溫箱中,使細(xì)胞輕度熱應(yīng)激,1h后恢復(fù)到37℃(抑制組),以未應(yīng)激(對(duì)照組)和單純41℃熱應(yīng)激1h后60min大鼠脾臟巨噬細(xì)胞(應(yīng)激組)為對(duì)照,分別檢測(cè)三組大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷、趨化功能。同時(shí)檢測(cè)P38MAPK蛋白和Bip蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:輕度熱應(yīng)激后60min,應(yīng)激組大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷活性增強(qiáng),與對(duì)照組、抑制組比較差異有顯著性(P0.01)。P38MAPK抑制劑預(yù)處理大鼠脾臟巨噬細(xì)胞,與應(yīng)激組比較,熱應(yīng)激后巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷活性明顯降低(P0.01),與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。應(yīng)激組P38MAPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào),與對(duì)照組和抑制組比較差異有顯著性(P0.01);P38MAPK抑制劑預(yù)處理后,抑制組P38MAPK蛋白表達(dá)受到抑制,與應(yīng)激組比較(P0.01)。Bip蛋白的表達(dá)也因P38MAPK抑制劑預(yù)處理而發(fā)生改變,由應(yīng)激組的1.2702±0.5345(Bip/β-actin)下降到抑制組的1.0281±1.0614(P0.05)。 結(jié)論:輕度熱應(yīng)激可增強(qiáng)大鼠巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷作用的同時(shí),P38MAPK、Bip蛋白表達(dá)上調(diào)。P38MAPK抑制劑可顯著抑制大鼠巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷功能以及P38MAPK、Bip蛋白的表達(dá)。P38 MAPK信號(hào)途徑參與Bip蛋白介導(dǎo)的輕度熱應(yīng)激后大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)。
[Abstract]:Isolation and culture of splenic macrophages from the first part of rats



Objective : To isolate and identify splenic macrophages in rats .



Methods : Sprague - Dawley rats were anesthetized by intraperitoneal injection of chloral hydrate , the spleen was sterilized by intraperitoneal injection , red blood cells in the spleen tissue cell suspension were prepared . The cells were incubated at 37 鈩，

本文編號(hào)：2023606