腸道菌群與肥胖等代謝綜合征發生、發展有著密切的聯系，但是高脂膳食調節腸道菌群及影響炎性反應的機制仍然不清楚。研究顯示，高脂膳食能夠引起機體氧化應激水平升高，尤其是引起腸道的氧化應激。而腸道是共生菌群棲息的環境，又由于不同的菌群氧化應激耐受性存在很大差異。因此，我們提出假設高脂膳食通過調節機體氧化還原狀態從而影響腸腔菌群結構組成，使進入派伊爾結的內生菌群結構發生改變，誘導腸道炎性細胞因子的產生，最終引起全身性炎癥反應及代謝綜合征的發生。 首先，高脂膳食誘導小鼠產生氧化應激模型及硫辛酸（LA）干預調節，來研究腸道氧化還原狀態對菌群結構的影響。通過檢測結腸，結腸內容物自由基（ROS）、丙二醛（MDA）、總抗（T-AOC）水平評價腸道氧化還原狀態；采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）及平板計數分析腸道菌群結構和數量。高脂膳食導致結腸，結腸內容物中ROS、MDA顯著上升，T-AOC水平顯著下降，添加LA后，能顯著降低高脂膳食引起的氧化應激。DGGE結果顯示，高脂膳食導致腸道菌群結構紊亂，出現高脂組特異性菌群，并且大腸桿菌、糞球菌數量顯著增加，乳酸菌數量顯著降低（P0.05）。LA處理后，菌群結構有所改善，大腸桿菌、糞球菌數量顯著下降，乳酸菌數量顯著增加。相關性分析顯示，ROS、MDA水平與大腸桿菌、糞球菌數量顯著正相關（P0.05），與乳酸菌顯著負相關（P0.05）。T-AOC與乳酸菌顯著正相關，但與大腸桿菌、糞球菌顯著負相關（P0.05）。 高脂膳食建立肥胖易感和肥胖抵抗兩種模型，及白藜蘆醇（RES）干預進一步評價氧化應激與腸道菌群間的關系。采用熒光原位雜交（FISH）與流式細胞相結合的方法分析腸道菌群，并對結腸炎性基因表達情況進行評價。結果顯示，氧化應激水平：肥胖易感組肥胖抵抗組正常組，添加RES后，，能顯著降低各組氧化應激水平。FISH及主成分分析顯示正常組、肥胖易感組、肥胖抵抗組三組腸道菌群存在顯著差異。肥胖易感組乳酸菌、雙歧桿菌數量顯著下降，腸桿菌屬數量顯著上升。擬桿菌與硬壁菌的比值：肥胖易感組肥胖抵抗組正常組，添加RES后，乳酸菌、雙歧桿菌數量顯著上升，腸桿菌屬數量顯著下降，擬桿菌與硬壁菌的比值顯著改善。相關性分析顯示，擬桿菌與硬壁菌門的比值與ROS、MDA顯著負相關（P0.05），與T-AOC顯著正相關（P0.05）。肥胖易感組能顯著增強NOD2和CARD9的表達，并選擇性地激活轉錄因子NF-κB，增強IL-8、IL-10、TNF-α、IL-23等細胞因子的分泌，引起機體嚴重炎癥反應。 研究高脂膳食誘導的肥胖易感和肥胖抵抗型小鼠派伊爾結內生菌群結構組成，及其對腸道炎癥的影響。結果發現，與正常組和肥胖抵抗組相比，肥胖易感組派伊爾結內生菌群豐度及多樣性顯著下降（P0.05）。正常組、肥胖抵抗組、肥胖易感組派伊爾結內生菌群種屬水平上差異顯著，表現為：肥胖易感組乳球菌屬（Lactococcus）、根瘤菌屬（Rhizobium）豐度顯著升高（P0.05），而Allobaculum和乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度顯著下降（P0.05）。另外，還有一些內生菌屬，如鏈球菌屬（Streptococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、從毛單胞菌屬（Comamonas）和黃桿菌屬（Flavobacterium），高脂膳食后，無論是肥胖易感組還是肥胖抵抗組都顯著增加。另外，肥胖易感型小鼠顯著上調派伊爾結炎性細胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ及IL-12的表達，其中IL-6、TNF-α與乳球菌屬、根瘤菌屬等呈顯著正相關，顯著抑制抗炎性細胞因子IL-10及TGF-β的表達（P0.05），其中IL-10與Allobaculum屬及乳桿菌屬呈顯著正相關。 對派伊爾結內生乳桿菌結構組成及其體外抗氧化特性進行研究。平板培養分離得到的92株乳桿菌經ERIC-PCR分型后，共得到13種不同的圖譜，主要分屬于羅伊乳桿菌等五個種，其中羅伊乳桿菌得到8株。體外抗氧化實驗結果顯示，肥胖易感組氧化應激耐受性弱的羅伊乳桿菌數量顯著下降，氧化應激耐受性強的羅伊乳桿菌數量增加。其中Lactobacillus reuteri L8氧化應激耐受性最強，只存在于高脂組，為高脂組特異羅伊乳桿菌，而Lactobacillus reuteri L3氧化應激耐受性最弱，高脂組中消失，為正常組特異羅伊乳桿菌。并且L3能夠促進派伊爾結抗炎性細胞因子IL-10的產生，抑制炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的產生，而且對LPS損傷的派伊爾結細胞有保護作用。 最后，研究兩株組特異性Lactobacillus reuteri L3和L8對機體代謝的影響。結果顯示，高脂組灌胃Lactobacillus reuteri L3，能顯著抑制高脂膳食引起的體重、血糖、血胰島素水平的增加，但此效果與抑制食物攝入量無關。高脂組灌胃Lactobacillus reuteri L3后，能顯著降低血LPS及炎性細胞因子的水平，而促進抗炎性細胞因子的分泌，另外，灌胃Lactobacillus reuteri L3后，通過下調肝臟中LPL及Scd1表達，上調Cyp7a1基因表達，促進肝臟組織中脂肪酸分解，并通過下調脂肪組織中PPAR-γ、ACC1和Fas的表達情況，抑制脂肪組織中脂肪酸合成。但高脂灌胃Lactobacillus reuteri L8后，對高脂膳食的改善效果不顯著。 綜上所述，高脂膳食通過誘導氧化應激導致腸道菌群結構紊亂，使進入派伊爾結的內生菌群結構發生改變，誘導腸炎性細胞因子的產生，并通過血液內毒素等引起機體炎癥，最終導致肥胖等代謝綜合征的發生。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R151

【參考文獻】

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本文編號：2126496