研究背景先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD)是最常見的出生缺陷之一,包括一系列的心血管畸形。目前認為是CHD患者的遺傳因素和其相關的環境因素共同作用的結果。心臟發育是一個精細的過程,與心臟發育相關的基因表達都受到精細的調控。除了基因序列的變異可以導致基因表達水平改變外,環境因素通過表觀遺傳學機制在基因表達調控方面的重要作用受到越來越多的重視。表觀遺傳學(Epigenetics)機制包括甲基化修飾、微小RNA調控及組蛋白修飾等。其中甲基化修飾是目前研究最多的表觀遺傳學現象。DNA甲基化是最常見的基因表觀修飾方式之一。它主要是指通過DNA甲基轉移酶將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到DNA胞嘧啶的5'位,形成5-甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因的序列,但是它可以調控基因的表達、維護染色體的完整性、調節DNA重組及某些基因的轉錄活性。啟動子是位于結構基因5'端上游的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之與模板DNA準確的結合并控制基因轉錄的起始和表達程度。啟動子對基因轉錄水平的調控主要表現為順式作用元件、反式作用因子及RNA聚合酶三者之間的相互協同作用,其本質為DNA與蛋白質、蛋白質與蛋白質之間的相互作用。啟動子區序列的變異可以通過影響轉錄因子等反式作用因子與順式作用元件的結合而導致基因轉錄水平的變化。除了序列的變化,越來越多的研究表明基因啟動子區DNA甲基化水平的改變能夠調控基因的轉錄水平。啟動子區CpG島甲基化增高將影響基因的轉錄,進而抑制基因的表達及功能,而去甲基化則誘導基因的重新活化和表達。甲基化和去甲基化主要通過直接和間接兩種機制控制基因的表達。直接機制是指CpG島甲基化直接通過抑制RNA聚合酶活性或干擾某些轉錄因子與基因調控區的結合而抑制基因的表達。間接機制主要包括兩種類型:1.基因啟動子調控序列甲基化后與甲基化CpG結合蛋白結合,阻止該基因與其它轉錄因子形成轉錄復合物;2.基因啟動子區DNA甲基化后通過改變染色質的結構進而阻礙基因DNA與轉錄因子結合。以往的研究表明,轉錄因子、信號分子、細胞粘附分子及離子通道分子是參與心臟發育的最主要有四類分子。其中,目前研究最多的是轉錄因子,包括鋅指家族、同源結構域家族、T-box(TBX)家族、基本螺旋-環-螺旋和MADS區域家族等。轉錄因子是指能與核酸特異性序列相結合的蛋白質,通過識別和結合基因啟動子區域的順式作用元件從而調控基因的表達。轉錄因子作用于下游基因的同時也同時受上游誘導信號的調節,它們構成一個復雜而精確的網絡對心臟的發育起重要的調節作用。T-box家族屬發育調控相關轉錄因子家族,通過其特有的T-BOX區域參與多種生物的發育調控。T-box家族均具有一個大的DNA結合域T-BOX,與其結合的所有DNA序列都存在一致性序列TCACACCT即T半位點,因此編碼該蛋白的基因稱為T-box基因。T-box基因家族分為5個不同的亞家族,其中主要與心臟發育相關的有TBX1亞家族的TBX1、TBX18、TBX20及TBX2亞家族的TBX2、TBX3和TBX5。它們通過協同和競爭機制在心臟的發育過程中起著重要的作用。法洛四聯癥(tetralogy of Fallot,TOF)是最常見的紫甜型先心病,約占先天性心臟病的10%,是胚胎時期圓錐動脈干發育異常所致,肺動脈狹窄、室間隔缺損、主動脈騎跨和右心室肥厚是其主要的病理特征。法洛四聯癥患兒自然預后不佳,若未及時診治大多在成年期前死于慢性缺氧導致的繼發性心肌肥大和心力衰竭。即使手術糾治仍有少部分患兒因術后心律失常等并發癥而發生猝死。法洛四聯癥作為臨床最常見的圓錐動脈干畸形,部分患者存在染色體及基因的突變,但目前還沒有明確致病基因的報道。目前認為與法洛四聯癥相關的基因有NKX2.5、TBX20、CX43、TBX1、GATA4、FOG2、TBX5、HIRA、RXAa、TGFβ 2、PAX3、VANGL2 等。TBX20的全稱為T-box20,定位于7號染色體的短臂14區2帶,屬于轉錄因子TBX家族的TBX1亞家族。通過對小鼠胚胎的研究顯示TBX20在心臟成環早期的心內膜墊有很強的表達,在后期的流出道、房室管及房間隔中隔前緣等心內膜墊結構的表達更加顯著。目前TBX20是T-box家族發現的唯一可以在心內膜墊穩定和廣泛表達的成員。而心內膜墊的異常發育可以導致多種先天性心臟病的發生,包括大動脈轉位、右室雙出道、法洛四聯癥、房室間隔缺損等。因此,TBX20基因是人類圓錐動脈干畸形候選基因之一。TBX2基因定位于染色體17q23,它在胚胎發育的各種組織和器官中廣泛表達。TBX2異常表達小鼠常伴有流出道間隔缺損及心腔特異性基因的異常表達。以往的研究表明,TBX20可以促進心腔心肌特異性基因的表達而抑制TBX2的表達,對心腔心肌的增殖和分化起著至關重要的研究。Cai等認為BMP2是TBX20在房室管發育中的關鍵下游基因之一,他們認為TBX20不僅直接抑制TBX2的表達,而且通過BMP2信號通路間接促進了 TBX2的表達。先前的研究表明TBX20突變僅發生于少部分先天性心臟病患兒中,TBX20序列的改變并不能完全解釋它在先天性心臟病中的致病作用。目前,對人類相關基因的甲基化研究主要集中在腫瘤組織中,而DNA甲基化在先天性心臟病中的致病作用研究甚少。研究目的1.檢測法洛四聯癥患兒右室流出道心肌組織TBX20基因啟動子區甲基化水平及TBX20基因mRNA及蛋白的表達。探討TBX20基因啟動子甲基化水平與TBX20基因表達的關系。2.檢測TBX20基因相關因子TBX2及BMP2在法洛四聯癥患兒心肌組織的mRNA及蛋白表達。探討TBX20與TBX2和BMP2之間的關系,并揭示它們在法洛四聯癥中的致病作用。3.探討TBX20基因啟動子區甲基化在法洛四聯癥的致病作用,為研究TBX20基因在法洛四聯癥的致病機制提出新的研究模式,進一步為先天性心臟病圍產期篩查提供理論依據。研究方法1.利用NCBI網站查找TBX20啟動子轉錄起始點上游2000 bp及下游1000 bp的序列。采用Methyl Primer Express Software vl.0查找TBX20基因啟動子區CpG 島分布情況。利用 Neural Network Promoter Prediction 查看 TBX20 基因核心啟動子序列。利用JASPAR軟件預測TBX20基因CpG島區與其它轉錄因子的結合位點。2.選取23例法洛四聯癥患兒及5例意外死亡兒童的心臟右室流出道心肌組織為研究對象。采用重亞硫酸鹽PCR測序方法檢測TBX20基因啟動子區的甲基化水平。采用熒光定量PCR檢測TBX20基因及其相關因子TBX2、BMP2的mRNA表達。通過蛋白質印跡實驗檢測TBX20基因及其相關因子TBX2、BMP2的蛋白表達。3.統計分析:采用SPSS 22.0及GraphPad prism v5軟件分析數據。正態分布數據以均值±標準差表示,非正態分布數據以中位數及四分位數表示。TBX20基因啟動子區甲基化水平、mRNA及蛋白相對表達的正態數據采用t檢驗,非正態數據采用Mann-Whitney檢驗。采用Spearman檢驗TBX20與mRNA是否具有相關性,P0.05為差異有統計學意義。結果1.利用生物信息學網站及軟件分析TBX20基因啟動子(-400bp～-48bp)位于CpG島內。該區域共含42個CpG位點,預測該區域含有多個轉錄因子結合位點(TFAP2、GATA5 及 TBX1/2/4/5 等)。2.法洛四聯癥組TBX20基因啟動子區(-400bp～-48bp)總體甲基化水平較對照組降低(P=0.035)。在42個CpG位點中,法洛四聯癥組第26 CpG位點甲基化水平較對照組降低(P=0.016)。其余位點兩組間差異無統計學意義。3.法洛四聯癥組右室流出道心肌組織TBX20基因mRNA表達較對照組明顯增高(P0.001),差異有統計學意義。法洛四聯癥組右室流出道心肌組織TBX20啟動子區(-400bp～-48bp)甲基化水平與其mRNA表達水平成負相關,r=0.81,P0.001。法洛四聯癥組右室流出道心肌組織TBX20蛋白表達較對照組增高(P=0.008),差異有統計學意義。4.法洛四聯癥組右室流出道心肌組織TBX2基因mRNA表達低于對照組,差異有統計學意義(P0.001)。法洛四聯癥組右室流出道心肌組織BMP2基因mRNA表達與對照組相比無明顯差異(P=0.082)。5.TBX2蛋白在法洛四聯癥組右室流出道心肌組織的表達低于對照組,差異有統計學意義(P=0.022)。法洛四聯癥組右室流出道心肌組織BMP2蛋白的表達與對照組相比差異無統計學意義(P=0.537)。結論1.TBX20基因啟動子區(-400bp～-48bp)含有多個轉錄調節元件,該區域甲基化的降低可能影響了 TBX20基因啟動子與TFAP2C的結合進而造成TBX20基因mRNA及蛋白表達增高。2.TBX20基因表達增高可以抑制TBX2基因mRNA及蛋白的表達。TBX20及TBX2基因的表達異常均可以導致心臟的發育異常,這可能是法洛四聯癥的致病機制之。3.TBX20基因啟動子區的甲基化水平異常可能在法洛四聯癥發病中起重要作用。本研究為進一步探索TBX20基因在法洛四聯癥中的致病機制提出了新的研究模式,同時為先天性心臟病的圍產期篩查提供了新的理論依據。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

圖１－１?ＴＢＸ２０基因啟動子（＿４００ｂｐ？＿４８ｂｐ）生物信息學分析：該區域共含４２??個ＣｐＧ位點，利用ＪＡＳＰＡＲ軟件預測該區域含多個轉錄因子結合位點。??

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?ＴＯＦ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖１－３?４：右室流出道心肌組織了８義２０基因啟動子區（－４０（＾口？－４８匕口）總體甲基??化水平分析，釆用Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ檢驗，右室流出道心肌組織ＴＢＸ２０??基因啟動子區（＿４００ｂｐ？－４８ｂｐ）第２６?ＣｐＧ位點甲基化水平比較。釆用??Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ?檢驗，０５〇??４２??
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本文編號：2889943