白頭翁皂苷糖基水解酶能夠特異性的水解白頭翁皂苷上的糖苷鍵,使多糖基白頭翁皂苷轉(zhuǎn)化為低糖基白頭翁皂苷,不僅能提高白頭翁皂苷的生物利用率,還可以提高其藥效價(jià)值。本論文主要對(duì)Absidia sp.P00r菌發(fā)酵產(chǎn)的白頭翁皂苷糖基水解II型酶的分離純化和基因調(diào)取進(jìn)行了研究。在Absidia sp.P00r菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),白頭翁皂苷糖基水解II型酶在以70%的槐花浸出液為誘導(dǎo)物配制的5°麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h時(shí),產(chǎn)量較大,誘導(dǎo)效果較好。利用DEAE-Cellulose(DE52)陰離子交換柱進(jìn)行分離純化,得到電泳純的白頭翁皂苷糖基水解II型酶蛋白,將該酶通過蛋白質(zhì)電印跡轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上后,經(jīng)過蛋白質(zhì)N-端序列測(cè)定,確定該酶N-端序列為YPDSVQHAETVQNLI。根據(jù)測(cè)得的白頭翁皂苷糖基水解II型酶蛋白N-端序列和測(cè)得的肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)登陸NCBI網(wǎng)站和Matrixscience網(wǎng)站的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),查找同源性,并根據(jù)同源性設(shè)計(jì)引物。根據(jù)白頭翁皂苷糖基水解II型酶的N-端序列設(shè)計(jì)簡并引物,以Absidia sp.P00r菌株的mRNA為模板,采用RT-PCR進(jìn)行基因序列的調(diào)取;根據(jù)3’RACE和5’RACE技術(shù)擴(kuò)增白頭翁皂苷糖基水解II型酶的3’端和5’端的基因片段并測(cè)序,得到白頭翁皂苷糖基水解II型酶的基因全序列,最后對(duì)調(diào)取的基因序列進(jìn)行序列分析。白頭翁皂苷糖基水解II型酶的基因全長為1376 bp,其中1~84 bp為5’UTR,長度為84 bp;85~1137 bp為基因的CDS區(qū),長度為1053 bp;可編碼351個(gè)氨基酸;1138~1365bp為3’UTR,長度為228 bp;1366~1376 bp為Poly A部分,長度為11 bp。
【學(xué)位單位】：大連工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

3圖 1-4 白頭翁皂苷 A 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1-4 Chemical structure of pulchinenoside A藥理作用作用白頭翁可以對(duì)利福平和異煙肼引起的血清谷同時(shí)有效增強(qiáng)了血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高增加所不同濃度的白頭翁皂苷可以在體外注射到小鼠吞噬作用，還可以促使它產(chǎn)生一定量的一氧化時(shí)維靜[13]等研究發(fā)現(xiàn)將白頭翁皂苷加入到肉雞

R 也被稱為逆轉(zhuǎn)錄 PCR，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一種廣應(yīng)用泛的變ACE 技術(shù)是已知全長 cDNA 序列中的某部分序列，從微量的轉(zhuǎn)錄本中’和 3’末端的有效方法[47]，該方法具有快捷、方便和高效等優(yōu)點(diǎn)[4為 3’RACE 和 5’RACE[49]。E 技術(shù)原理 技術(shù)通常可分為 3’RACE 和 5’RACE，其主要依據(jù)是根據(jù)擴(kuò)增區(qū)ACE 技術(shù) Poly(A)+RNA 逆轉(zhuǎn)錄成帶有 3’RACE Adaptor 銜接頭的 cDNA 鏈 cDNA 作為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。 使用專門用于正向引物的 GS 3’RACE Outer Primer。獲得已知信息區(qū)域和 poly(A)尾部區(qū)域之PCR期間可能發(fā)生非特異性條帶過程，所以通常需要使用上述引物嵌套 PCR）進(jìn)行 PCR 步驟，其原理如圖 1-5 所示：

第一章 文獻(xiàn)綜述5’RACE 技術(shù) 3’RACE 相比，5’RACE 相對(duì)難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)?5’真核 mRNA 的末端沒有特。主要步驟是：從暴露的 mRNA 中去除不完整的磷，除去 mRNA 的 5’末T4 連接酶 5’RACE 銜接子連接 mRNA。使 5’特異性序列上的引物和該序列引物結(jié)合進(jìn)行 5’RT-PCR 末端的反應(yīng)。其原理如圖 1-6 所示。
【參考文獻(xiàn)】

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