第一章基于病例對照及薈萃分析的NRG1多態性與先天性巨結腸癥易感性研究背景:先天性巨結腸癥(Hirschsprung disease,HD)是腸神經系統(Enteric nervous system,ENS)發育畸形最常見的類型,其易感性與基因多態性密切相關。NRG1基因是通過全基因組關聯研究首次在中國人群發現的HD易感基因,其多態性位點rs7835688、rs16879552與HD發病密切相關。迄今為止,已有多項病例-對照分子流行病學研究在不同人群中對這2個位點與HD的易感性進行了重復與驗證,但結論并不一致。因此本文擬進一步深入探討rs7835688、rs16879552多態性與HD遺傳易感性之間的關系。方法:(1):首先采用大樣本病例-對照分子流行病學關聯性分析,定點研究NRG1基因rs7835688、rs16879552位點與中國人群HD發病風險的關系。(2)利用公共數據庫(Pub Med、EMBASE、Web of Science)檢索已發表的文章數據,結合前一步的Taq Man基因分型數據進行薈萃分析,討論rs7835688、rs16879552與HD的關聯。(3)將所有的研究對象分為黃種人與白種人二個人群進行亞組分析,探索rs7835688、rs16879552與不同種族之間的人種-基因交互作用。(4)根據HD的臨床類型,將其分為短段型、長段型/全結腸型二個亞組,探討rs7835688、rs16879552與不同臨床類型HD之間的基因-表型交互作用。結果:(1)病例-對照關聯分析顯示,無論在何種遺傳模式下,rs7835688與HD的患病風險均呈正相關,而rs16879552則與HD的患病風險并無關聯。(2)薈萃分析一共納入9項臨床研究,7項關于亞洲人,2項研究對象為白種人。所有文獻均采用病例-對照設計,其中2篇為全基因組關聯分析(GWAS),7篇為基因定點分析(Fine-mapping)。對所有文獻的對照組基因型分布進行哈-溫平衡驗證,其中5篇符合哈-溫平衡標準,另外4篇由于基因型頻率數據不完整而無法計算。5項研究對照組來源于社區人群,4項研究對照組來源于醫院人群。(3)在所有遺傳模型中,rs7835688均增加HD患病風險;對于rs16879552,除了顯性遺傳模型下與HD無明顯關聯,其他三種遺傳模型下rs16879552等位基因C均明顯增加HD易感性。(4)基于人種的亞組分析顯示,對于rs7835688,4種遺傳模型下均與黃種人HD易感性相關,而與白種人無明顯關聯;對于rs16879552,在純合模型、隱性模型、等位基因模型下與黃種人HD風險顯著相關,但與白種人HD遺傳易感性無關聯。(5)基于HD臨床分型的亞組分析顯示,rs7835688在4種遺傳模型下均與短段型HD易感性相關,但不增加長段型/全結腸型HD的患病風險;而rs16879552僅在等位基因模型下與長段型/全結腸型HD相關。結論:NRG1基因多態性位點rs7835688、rs16879552可增加亞洲人群HD遺傳易感性,但與白種人HD患病風險之間的關系并不確切,其潛在的生物學機制尚需更多研究去進行探討。第二章全基因組測序篩選先天性巨結腸癥新易感基因ALK及其功能鑒定背景:先天性巨結腸癥(HD)是引起小兒功能性腸梗阻最主要的消化道畸形,屬于腸神經系統(ENS)發育異常性疾病,結腸粘膜下及肌間神經節細胞缺失是該病主要的病理改變,腸神經嵴細胞(ENCC)在ENS發育過程中遷移停滯是引起HD的內在原因。ENCC在定植分化為腸神經元的過程中,必須適應不斷變化的腸道微環境,整個過程由來源于神經嵴和腸道微環境的特定信號通路分子和轉錄因子調控。任何編碼這些分子的基因發生突變,都有可能影響到整個ENCC的定植過程,成為HD的致病基因。目前已知的基因及其變異位點并不能解釋所有HD病例發病原因,因此本研究主要通過全基因組測序,系統繪制HD相關的基因組變異圖譜,篩選出新的易感基因。在此基礎上,進行進一步的功能驗證,探索基因突變對ENCC生物學行為的影響。方法:(1)收集13份全結腸巨結腸患兒及其父母外周血標本,提取基因組DNA進行全基因組測序。通過生物信息學分析過濾各種遺傳變異,鑒定出與HD發病相關的顯著突變基因。(2)NCBI GEO Datasets數據庫查找突變基因ALK在人體胚胎組織的表達情況。(3)免疫組織化學技術、PCR及Western-blot檢測ALK在病變組織及正常結腸中的表達差異。(4)用攜帶ALK sh RNA的敲低載體轉染原代培養的ENCC,通過MTT實驗、RTCA細胞實時分析實驗觀察該基因敲低對ENCC增殖、遷移能力的影響。結果:(1)基因編碼區發現了2149個突變,其中ACMG預測為有害/可能有害的突變有1927個,共有突變篩選發現222個突變。(2)采用SIFT、Polyphen、Mutation Taster、CADD等軟件對篩選出來的位點進行受累氨基酸化學性質分析、序列保守性分析及生物信息學預測,最終確定ALK為新的HD候選基因。ALK基因在2例患兒中存在突變,其中1例為純合突變:c.C1648T[p.L550F];另一個樣本中為復合雜合突變:c.C3035T[p.T1012M]與c.G487T[p.V163L]。(3)數據庫中RNA表達譜芯片數據集顯示ALK于胚胎期在胃及結腸組織中的表達明顯高于其他組織。(4)ALK主要表達于腸神經節及神經纖維,位于胞漿及細胞膜。與正常結腸組織相比,基因突變患兒狹窄段結腸ALK m RNA及蛋白表達明顯降低。(5)在ENCC細胞系中運用sh RNA技術敲低ALK表達后細胞的增殖及遷移能力明顯降低。結論:(1)采用全基因組測序技術對先天性巨結腸的各類遺傳變異進行了篩選,包括In Dels、SNV、SV及CNV等,篩選出ALK基因錯義突變可能與HD的發病密切相關。(2)ALK與ENCC的生物學行為密切相關,其表達降低可抑制ENCC的增殖與遷移能力。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R726.5
【部分圖文】：

一共有9 項臨床研究探討了 rs7835688 和/或 rs16879552 與 HD 的遺傳易感性。研究路線如圖1 所示。圖 1 薈萃分析技術路線圖3、納入研究基本情況9 項臨床研究中，7 項關于亞洲人[5, 12, 18-22]，2 項研究對象為白種人[13, 14]。所有文獻均采用病例-對照設計，其中 2 篇為全基因組關聯分析（GWAS），7 篇為基因定點分析（Fine-mapping）。我們對所有文獻的對照組基因型分布進行哈-溫平衡驗證，其中 5 篇符合哈-溫平衡標準，另外 4 篇由于基因型頻率數據不完整而無法計算。5 項研究對照組來源于社區人群（P-B），4 項研究采用以醫院為基礎的病例-對照設計（H-B）。各研究的基本特征在表 3 中具體描述。納入文獻的評分在 9-11 分之間

rs7835688與HD患病風險的關聯性

中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文檢驗及發表偏倚（rs7835688）目遺傳模型 異質性檢驗 發Q P value I2(%) BegCC vs GG 20.5 3.977E-04 80.5 –CC vs CG+GG 32.62 1.430E-06 87.7 –CC+CG vs GG 9.57 4.838E-02 58.2 –C vs G 30.67 7.141E-05 77.2 0
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 陳爍;周春菊;馬曉莉;宮麗平;;兒童神經母細胞瘤ALK基因及其表達的異常[J];中華病理學雜志;2014年08期

2 Adam S Wallace;Richard B Anderson;;Genetic interactions and modifi er genes in Hirschsprung's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年45期

本文編號：2892536