金魚(yú)草是多年生草本植物,是玄參目玄參科金魚(yú)草屬金魚(yú)草種。金魚(yú)草是廣泛應(yīng)用的園林栽培觀賞植物,擁有繁多的品種和較廣的生態(tài)位,在世界切花市場(chǎng)也有重大地位,也是研究植物葉序變化的優(yōu)良植物之一。植物葉序發(fā)育主要是由于葉原基生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)育形成的,目前研究中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)其起到重要作用,PIN家族蛋白主要控制生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸,研究PIN家族有利于闡明植物葉序發(fā)育的部分機(jī)理。研究以金魚(yú)草為試材,克隆了金魚(yú)草的AmPIN1a基因,并將此基因構(gòu)建到表達(dá)載體上,通過(guò)浸花法侵染擬南芥獲得過(guò)表達(dá)AmPIN1a轉(zhuǎn)基因擬南芥,觀察其表形并用外源IAA對(duì)其進(jìn)行處理,以探究金魚(yú)草AmPIN1a基因的功能。獲得了如下主要結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)研究以金魚(yú)草為研究材料,通過(guò)對(duì)金魚(yú)草幼芽頂端分生組織轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)。在同一時(shí)期金魚(yú)草的對(duì)生葉序枝條和互生葉序枝條間PIN1基因表達(dá)量有較大差異。利用NCBI通過(guò)Blast同源搜索尋找到金魚(yú)草同源PIN1a基因,根據(jù)搜索到的序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù)從金魚(yú)草中克隆出AmPIN1a基因。2.通過(guò)熒光定量PCR,對(duì)AmPIN1a基因在金魚(yú)草中的組織表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)AmPIN1a在金魚(yú)草生長(zhǎng)周期內(nèi)不同器官中都有表達(dá),幼苗期表達(dá)量:莖根葉,成年期表達(dá)量:莖葉花根。3.AmPIN1a基因全長(zhǎng)CDS為1836bp,和其他物種PIN基因同源性較高;編碼611個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量為66.78kD,等電點(diǎn)為8.95,編碼的蛋白是親水型蛋白質(zhì);氨基酸序列分析顯示其蛋白含有2個(gè)Mem_trans superfamily結(jié)構(gòu)域。4.構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a,通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV1301中,利用浸花法侵染野生型擬南芥并經(jīng)過(guò)數(shù)代篩選得到了純合子AmPIN1a轉(zhuǎn)基因擬南芥。5.種植野生型擬南芥和AmPIN1a轉(zhuǎn)基因擬南芥并觀察發(fā)現(xiàn),在0-12天時(shí)AmPIN1a轉(zhuǎn)基因擬南芥主根略短于野生型擬南芥,側(cè)根數(shù)量明顯增多。移栽土壤后前期葉片大小也小于野生型,24天左右后葉片才超過(guò)野生型,并顯著區(qū)別,花序軸萌發(fā)晚,但發(fā)育較快。6.在外源IAA處理下,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AmPIN1a基因的擬南芥相比野生型擬南芥表現(xiàn)出對(duì)IAA刺激更加敏感的性狀,暗示該基因可能在植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸中起到相關(guān)作用。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S682.19
【部分圖文】：

圖 1.2 圖為三種野生的擬南芥頂端分生組織[20]A：電子顯微鏡下，頂端分生組織（SAM）和五個(gè)中的兩個(gè)可見(jiàn)的花分生組織(FM)。花分生組織每次以螺旋的方式進(jìn)行排列，因此可以通過(guò)觀察花分生組織來(lái)判斷花分生組織的生長(zhǎng)時(shí)期。花分生組織成熟的標(biāo)志是擁有了 4 片萼片原基。B：莖尖電子顯微鏡掃描結(jié)果顯示頂端分生組織和剛形成的花分生組織和老的花分生組織。C：圖 1B 中的頂端分生組織詳情。較少的細(xì)胞組成了頂端分生組織。標(biāo)尺是 50um。Fig 1.2 Three Views of SAMs of Arabidopsis (Ler Wild-Type)A: Scanning electron micrograph, with SAM and two of the five visible floral meristems (FM) indicated. FMs areinitiated in a spiral pattern and one at a time, so the meristems that are visible show different stages of FM growth.The most mature is initiating four sepal primordia.(B) Transmission electron micrograph of a similar apex, showing SAM and a recently initiated FM as well as anolder FM.(C) Detail of the SAM shown in Figure 1B. Note how few cells constitute the SAM. Scale bars: 50 um.莖頂端分生組織形成分化產(chǎn)生葉原基，葉原基出現(xiàn)后自身形成分化產(chǎn)生葉片，這一過(guò)程稱為葉片的發(fā)育過(guò)程。葉基、葉形、葉脈、葉緣和葉尖是葉片的重要外部特征，是不同物種間分辨的重要依據(jù)。除了復(fù)葉外，成熟的單葉有 3 個(gè)不對(duì)稱軸，分別是：基-頂軸(由葉的基部指向尖部)；和中-邊軸(從葉的主脈指向邊緣)；腹[21]

圖 1.3 PIN 蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)[75]Fig 1.3. The predicted structure of PIN proteinsIN 基因的表達(dá)既具有組織和器官特異性，又有重疊性。P定了其在發(fā)育中扮演了特定的角色。PIN1 是 PIN 家族中研1 突變體的表型是 PIN 基因家族成員突變體表型最明顯的，PIN1 基因在擬南芥的各個(gè)器官均有轉(zhuǎn)錄。利用 PIN1 蛋(immunolocalization)，結(jié)果顯示在根尖的中柱組織和內(nèi)皮1 蛋白的信號(hào)，在表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞的底部細(xì)胞膜上也 PIN1 介導(dǎo)生長(zhǎng)素向根尖運(yùn)輸，在花序莖中 PIN1 蛋白定位的底部細(xì)胞膜上。IN 家族中，PIN1 蛋白是唯一能在莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)有表達(dá)信號(hào)的IN1 朝向高濃度生長(zhǎng)素的細(xì)胞膜上極性定位，增強(qiáng)生長(zhǎng)素期膨脹的原基和其臨近的區(qū)域形成一個(gè)生長(zhǎng)素釋放區(qū)，誘已經(jīng)存在的原基一定距離的地方形成。在胚發(fā)育過(guò)程中有明顯的動(dòng)態(tài)變化。1-16 細(xì)胞期時(shí)，PI

圖 3.1 pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建Fig 3.1 Construct of expression vectors of pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a載體構(gòu)建過(guò)程如下：一）提取 pCAMBIA1301 質(zhì)粒從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的含有 pCAMBIA1301 載質(zhì)粒的大腸桿菌中提取 pCAMBIA1301 載體質(zhì)粒。1) 先將水浴鍋預(yù)熱 65oC。提取在 LB 液體培養(yǎng)中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液 1-4mL，放入L EP 管中，設(shè)置程序?yàn)?12000×g 離心 1min，丟棄上清液。2) 在菌體沉淀中加入 250μL 的 Buffer S1（需事先加入 RNase A）懸浮菌體沉淀槍頭打碎混勻，不要留有小的菌塊。3) 在 EP 管中加入 250μL Buffer S2，溫和上下顛倒混勻 4.6 次，讓細(xì)菌充分裂解到溶液變得透亮，開(kāi)瓶蓋時(shí)候會(huì)有拔絲狀物質(zhì)，注意時(shí)間不要超過(guò) 5min。4) 再在 EP 管中加入 350μL Buffer SS 溫和上下顛倒混勻 6-8 次，設(shè)置程序?yàn)?000×g 離心 10min。5) 吸取 4 步驟中的上清液轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管放入 2mL 離心管中，設(shè)置
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2892434