【目的】驗證牛支原體P48蛋白在細胞中的位置,并為后續(xù)功能的研究奠定基礎.【方法】運用Overlap PCR擴增獲得點突變后的牛支原體武威分離株P48基因,并將其克隆至pGEM-T Easy,將測序正確的質(zhì)粒克隆至表達載體pET-28a中,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-P48,表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),并在IPTG誘導下成功獲得融合蛋白表達產(chǎn)物rMbP48,大小約為51ku.重組蛋白純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體.在分離牛支原體膜蛋白的基礎上應用Western-blot及間接ELISA對P48蛋白在細胞中的分布進行分析.【結(jié)果】P48蛋白主要存在于牛支原體的膜分離相.全菌免疫熒光試驗進一步證實脂蛋白P48位于牛支原體的膜表面.【結(jié)論】牛支原體P48蛋白是存在于牛支原體表面的一種具有免疫原性的脂蛋白.本研究為進一步研究P48蛋白的生物學特性及建立高效的牛支原體診斷方法奠定了基礎.
【部分圖文】：

第２期胡國明等：牛支原體武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克壟原核表達及亞細胞定位并連接轉(zhuǎn)化，陽性質(zhì)粒酶切鑒定并測序，鑒定正確的重組表達質(zhì)粒命名為ｐＥＴ－Ｐ４８（圖２）．Ｍ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標準；１：牛支原體武威株Ｐ４８基因．圖１牛支原體Ｐ４８基因的ＰＣＲ鑒定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標準；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鑒定．圖２重組質(zhì)粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鑒定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原體武威分離株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ檢測結(jié)果顯示，該基因在牛支原體ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分離株的Ｐ４８基因序列同源性為１００％．Ｐ４８基因與無乳支原體的某些基因亦有很高的同源性，其中與Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均達到８０％（表３），且上述３個基因與牛支原體Ｐ４８基因相比均存在兩處共９個堿基的缺失．雖然牛支原體Ｐ４８基因與無乳支原體上述３個基因具有較高的同源性，但與無乳支原體其他菌株序列具有較大差異，遺傳距離較遠（圖３）．除此之外，在其他種屬支原體基因組中均未

第２期胡國明等：牛支原體武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克壟原核表達及亞細胞定位并連接轉(zhuǎn)化，陽性質(zhì)粒酶切鑒定并測序，鑒定正確的重組表達質(zhì)粒命名為ｐＥＴ－Ｐ４８（圖２）．Ｍ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標準；１：牛支原體武威株Ｐ４８基因．圖１牛支原體Ｐ４８基因的ＰＣＲ鑒定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標準；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鑒定．圖２重組質(zhì)粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鑒定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原體武威分離株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ檢測結(jié)果顯示，該基因在牛支原體ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分離株的Ｐ４８基因序列同源性為１００％．Ｐ４８基因與無乳支原體的某些基因亦有很高的同源性，其中與Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均達到８０％（表３），且上述３個基因與牛支原體Ｐ４８基因相比均存在兩處共９個堿基的缺失．雖然牛支原體Ｐ４８基因與無乳支原體上述３個基因具有較高的同源性，但與無乳支原體其他菌株序列具有較大差異，遺傳距離較遠（圖３）．除此之外，在其他種屬支原體基因組中均未

；２：ＣＱ－Ｗ０７；３：ＨＢ０８０１；４：Ｈｕｂｅｉ－１；５：Ｍａ５６３２；６：ＭａＰ４８ａｎｄＰ５９；７：ＭａＰＧ２；８：ＭａｓｔｒａｉｎＰＫ０１ＡＲＰ４８ｇｅｎｅ；９：ＭａｓｔｒａｉｎＲＬ１４／９５－９６Ｐ４８ｇｅｎｅ；１０：Ｐ４８ｇｅｎｅ；１１：Ｍａｓｔｒａｉｎ１７／９５－９５Ｐ４８ｇｅｎｅ；１２：ＭａｓｔｒａｉｎＶＰ１２／０５Ｐ４８ｇｅｎｅ．Ｍ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標準；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鑒定．圖３Ｐ４８基因核苷酸進化樹分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰ４８ｇｅｎｅ２．３重組蛋白的表達將重組表達質(zhì)粒ｐＥＴ－Ｐ４８轉(zhuǎn)入大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３），經(jīng)終濃度為１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ誘導，獲得重組蛋白的可溶性表達產(chǎn)物與預期一致，其分子量大小約為５１ｋｕ（圖４）．２．４兔抗ｒＭｂＦ８多抗的制備及Ｐ４８的亞細胞定位采集Ｐ４８重組蛋白４免后的新西蘭大白兔血液分離血清，所得多克隆抗體效價高達１∶２５６００．牛支原體胞漿蛋白、膜蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測結(jié)果顯示，牛支原體Ｐ４８蛋白絕大部分存在于外膜（圖５）．ＥＬＩＳＡ結(jié)果進一步證明牛支原體Ｐ４８蛋白在膜表面所占比例遠大于胞漿蛋白（圖６）．免疫熒光試驗結(jié)果顯示，抗ｒＭｂＦ４８重組蛋白多克隆抗體處理的支原體表面可結(jié)合熒光標記的二抗，從而可見明顯的熒光，而陰性血清處理的牛支原５

本文編號：2893826