植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到很多非生物脅迫的威脅,例如高pH、氧化、干旱、熱、鹽等脅迫,都嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。Ca~(2+)是植物中普遍存在的第二信使,廣泛參與植物的生長(zhǎng)狀態(tài)、衰老速度的調(diào)控,在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫等方面也起著重要的作用。鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)是一組鈣離子感受器,能夠與一類蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK)互作來(lái)解碼特異Ca~(2+)信號(hào),從而對(duì)逆境脅迫作出響應(yīng)。CBL家族在許多物種中都有研究,但目前對(duì)大豆CBL家族的研究較少。本文以“黑農(nóng)52”為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)分析了高pH、高鎂、氧化脅迫條件下大豆GmCBL2基因的表達(dá)模式,并分析了該基因的生物信息學(xué)特征;通過(guò)同源克隆技術(shù),從大豆中克隆了與擬南芥AtCBL2基因同源的GmCBL2基因,并構(gòu)建了GmCBL2基因的植物過(guò)表達(dá)載體,將該基因成功轉(zhuǎn)化到煙草中。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗逆性分析,確定了該基因與非生物脅迫耐受性的關(guān)系。獲得的主要研究成果如下:1.GmCBL2基因在逆境脅迫下的表達(dá)模式分析對(duì)大豆幼苗分別進(jìn)行高pH(100mmol/L NaHCO_3)、高鎂(20mmol/L MgCl_2)、氧化(10mmol/L H_2O_2)脅迫處理,通過(guò)qRT-PCR分析GmCBL2基因在0、1、5、12、24h的表達(dá)模式,結(jié)果表明,GmCBL2基因?qū)θN脅迫均有不同程度的應(yīng)答,但被氧化脅迫誘導(dǎo)最顯著。2.GmCBL2基因的克隆與序列分析根據(jù)擬南芥AtCBL2基因序列在大豆數(shù)據(jù)庫(kù)(www.Phytozome.com/soybean)進(jìn)行同源比對(duì)獲得大豆同源序列GmCBL2,通過(guò)RT-PCR克隆獲得GmCBL2基因CDS序列,該序列全長(zhǎng)681bp,編碼226個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,GmCBL2蛋白與木豆中的同源蛋白的親緣關(guān)系最近。3.GmCBL2基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建了pBWA(V)HS-GmCBL2植物過(guò)表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,獲得了轉(zhuǎn)GmCBL2基因的PCR陽(yáng)性植株。RT-PCR結(jié)果證明GmCBL2已在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。4.轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性鑒定對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了100mmol/L NaHCO_3、10mmol/L H_2O_2、20mmol/L MgCl_2脅迫下的表型分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株離體葉片在高pH、高鎂脅迫下葉片均黃化,但在氧化脅迫下轉(zhuǎn)基因植株葉片仍然保持鮮綠,而野生型葉片黃化明顯。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了10mmol/L H_2O_2脅迫下的氧化脅迫相關(guān)生理指標(biāo)(POD、CAT、SOD、MDA)分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株清除活性氧自由基的能力總體高于野生型植株,表明GmCBL2能夠通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)植株對(duì)氧化脅迫的抗性。
【學(xué)位單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

哈爾濱師范大學(xué)碩士學(xué)位論文個(gè) CBL 成員都有自己的位置特點(diǎn)和功能屬性。例如，CBL1，CBL4，CBL5L9 具有雙重脂質(zhì)修飾位點(diǎn)的 N 端（MGCXXS）[14]；CBL4 的脂質(zhì)修飾位點(diǎn)賴氨酸殘基（KKKKK），推測(cè)該區(qū)域有助于與磷脂之間的相互作用[15]。CBL19 主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜上[16]，但 CBL4和 CBL5 則在全細(xì)胞中均存在定位[17]。 的 N 末端由 21 個(gè)疏水性氨基酸殘基替代脂質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域，使自身能夠從液靶向到細(xì)胞質(zhì)膜[18]。Lin 等人也證明 CBL10 被磷酸化后可以與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)究還表明，負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)膜靶向的 N 末端疏水殘基約為 25 個(gè)氨基酸組成[19]。CBL3 和 CBL6 具有延伸的 N 端，它負(fù)責(zé) CBL 蛋白的液泡膜定位[17]。此外，是由 N 端的三個(gè)半胱氨酸殘基的脂質(zhì)修飾作用而成[20]。CBL3 和 CBL6 定位膜上[14]，而 CBL7 和 CBL8 存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[19]。相關(guān)數(shù)據(jù)還顯示族能夠感知由脅迫應(yīng)激引起的胞質(zhì)鈣信號(hào)，并作為壓力信號(hào)傳導(dǎo)。

6圖 1-2 植物應(yīng)答逆境的 CBL-CIPK 信號(hào)途徑[34, 49]Fig.1-2 CBL-CIPK signal pathway of plants response to stresses. 展望述，CBL-CIPK 網(wǎng)絡(luò)信號(hào)系統(tǒng)可以響應(yīng)植物對(duì)逆境的應(yīng)答IPK 復(fù)合體傳遞逆境 Ca2+信號(hào)的過(guò)程。盡管在該領(lǐng)域很多研但是仍有很多 CBLs 未知功能有待研究。目前已經(jīng)從擬南芥抗逆基因，也從一些模式植物中了解到一些相關(guān)生化機(jī)理一復(fù)雜通路，仍需要關(guān)于 CBL-CIPK 功能機(jī)理的更多研究作物耐逆新品種的育種實(shí)踐。

圖 2-3 三種脅迫下 GmCBL2 基因的表達(dá)模式Fig.2-3 The expression patterns of GmCBL2 gene under different stresses2.4 討論植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到各種環(huán)境因子的影響，不良的環(huán)境因子會(huì)抑制甚至損害植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。基因在不同時(shí)間段、不同脅迫條件下的表達(dá)特征可以反映出基因在抵御逆境過(guò)程中的功能特點(diǎn)。目前已有越來(lái)越多的研究表明CBL 家族對(duì)植物的不同脅迫有響應(yīng)。擬南芥基因組含有 10 個(gè) CBL 基因，大多基因都參與脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑[3]。已有研究表明 AtCBL2 基因參與高 pH 和鎂脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[35]，因此本試驗(yàn)也進(jìn)行了高 pH 和高鎂處理，來(lái)檢測(cè) GmCBL2 是否也具有這樣的功能。擬南芥 AtCBL2和 AtCBL3 在高鎂環(huán)境下，可以與下游靶細(xì)胞結(jié)合，從而防止植物受其侵害[35]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AtCIPK3/9/23/26 與 AtCBL2/3 是在液泡膜上進(jìn)行互作，可以將細(xì)胞內(nèi)多余的 Mg2+流入液泡，而且 Atcipk3/9/23/26 突變體同樣對(duì) Mg2+有高度的敏感性[34-35]
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