克氏原螯蝦(Procambarus clarkii),俗稱小龍蝦、紅螯蝦等,其食性雜、生長快且適應力極強,自上世紀三十年代傳入我國,因肉質鮮美而深受人們喜愛,之后快速占據淡水蝦類經濟產業的重要地位,現已成為世界上商品價值最大的蝦類之一。十幾年前南京的“龍蝦門”事件,使人們對克氏原螯蝦的病害情況開始有了重視,也吸引了越來越多的科研人士著手研究其染病、抗病等內容。另外,隨著人們對克氏原螯蝦的熱情進一步高漲,供不應求的情況時有發生,這就迫使養殖戶更大規模地進行養殖,隨之而來的也是克氏原螯蝦患病幾率的增加及感染病原體的多樣;而克氏原螯蝦同其他無脊椎動物一樣,僅依靠先天免疫來防御病原入侵,因此對克氏原螯蝦先天免疫的研究更顯得尤為重要。本課題研究了Caspase-3C、Lectin和LGBP三種重要的免疫基因在克氏原螯蝦體內的免疫功能,并得到以下結果:1、在克氏原螯蝦體內克隆到一種半胱氨酸蛋白酶基因,命名為PcCaspase-3C,該基因全長4684 bp,其包含一個1572 bp的開放閱讀框(ORF),編碼523個氨基酸。該蛋白含有一個由237個氨基酸組成的CASc結構域和一個低復雜度區域。該基因主要表達于心臟、胃和腸道,在肝胰腺和鰓中表達量較低,在血細胞中表達最少。受金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌或白斑綜合征病毒(WSSV)刺激后,PcCaspase-3C在腸、胃中的表達水平均有不同程度的上調。將該基因干擾后,再用副溶血弧菌刺激克氏原螯蝦,發現有部分抗菌肽的表達被抑制,如ALF2、ALF5、ALF6、Cru4和Lys。將該基因敲低后,用WSSV感染克氏原螯蝦,WSSV的拷貝數有明顯增加。根據以上結果,推測PcCaspase-3C在克氏原螯蝦抗細菌和抗病毒免疫應答中發揮重要作用。2、C型凝集素作為一類模式識別受體(PRRs)在甲殼動物的先天免疫中發揮重要作用。在本研究中,我們在克氏原螯蝦中發現了一種新的凝集素基因(PcLectin),該基因全長1025 bp,包括528 bp的ORF,編碼175個氨基酸的蛋白。PcLectin蛋白含有一個信號肽和一個糖識別結構域(CRD)。該基因在胃中表達水平最高,在肝胰腺中表達較少,在其他組織中幾乎不表達。在感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌或WSSV的蝦中,PcLectin的表達均出現不同程度的上調。將該基因敲低后,用副溶血弧菌刺激克氏原螯蝦,部分抗菌肽的表達被抑制(ALF2、ALF6、Cru2、Cru4)。將該基因進行體外原核重組表達,發現重組表達的蛋白對幾種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和多糖均具有結合活性,且能以Ca~(2+)依賴的方式凝集細菌。綜合以上結果,我們認為,PcLectin參與了克氏原螯蝦先天免疫防御。3、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結合蛋白(LGBP)作為一種模式識別受體,參與無脊椎動物先天免疫。本研究中,我們在克氏原螯蝦體內克隆到一個LGBP基因,全長1327 bp,包括1113 bp的ORF,編碼由370個氨基酸殘基組成的蛋白質,其含一個信號肽、一個糖苷水解酶活性結構域(Glyco_hydro_16)和一個低復雜度區域。經過研究,發現該基因在不同組織中的表達存在性別差異,在健康的克氏原螯蝦體內,在雌蝦各種組織中的表達量幾乎都低于雄蝦。無論是雌蝦還是雄蝦,都是在肝胰腺中表達最高,其他組織中表達較少,腸道中表達最少。經副溶血弧菌或脂多糖(LPS)刺激后,該基因在雌體和雄體中的變化情況亦有差異,但在胃和肝胰腺中的表達整體呈上升趨勢。在雄蝦的肝胰腺中,將PcLGBP基因敲低后,多種抗菌肽基因的表達都受到抑制。體外重組表達的LGBP蛋白(rPcLGBP),對LPS、Glu和PGN都有不同程度的結合活性,并且可以結合多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。酚氧化酶活性測定實驗結果表明,在正常雄蝦的肝胰腺、鰓和胃中,其酚氧化酶活性均顯著高于雌蝦。在雄蝦肝胰腺中,將PcLGBP敲低后,酚氧化酶活性降低。重組的LGBP蛋白和β-1,3-葡聚糖(Glu)或LPS孵育后可以明顯提高肝胰腺的酚氧化酶活性。以上結果表明LGBP不僅可以參與抗菌肽基因的表達調控,還可以參與酚氧化酶的活化;在雄蝦體內,其表達水平較高,賦予雄蝦較高的酚氧化酶活性。
【學位單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

第一章 緒 論得尤為重要[25]。如圖 1.1 所示，當模式識別受體識別病原微生物表面的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan，Glu）等多糖時[26-28]，廣泛存在于血液和甲殼內層組織中的酚氧化酶原便被特異性激活，并被水解為有活性的酚氧化酶，進而促進單酚逐步氧化成聯苯酚和具有毒性的醌，而醌會自發地生成黑色素，并與黑色素一起參與防御反應，殺滅入侵的病原，[22,29]；其中防御過程包括提供調節因子、促進血細胞吞噬作用、包囊作用和結節的形成[25]，同時也可以介導凝集和凝固，產生殺菌物質（溶菌酶等）[30]。這種反應非常劇烈且高效，機體為了防止錯誤地合成有毒物質醌，也發展出很嚴密的調控機制。在甲殼動物體內，酚氧化酶原主要由成熟血細胞（顆粒細胞或半顆粒細胞）產生并貯存，一旦被微生物表面的多糖或者脂多糖-β-1,3-葡聚糖結合蛋白、β-葡聚糖結合蛋白等觸發，就會以脫顆粒的方式釋放到血漿中，隨后被水解并在短時間內產生大量的級聯反應，其中蛋白酶抑制劑可以限制這種級聯反應，從而確保此反應不會因為過早或過激發生而危害機體[29, 31]。

起始 caspase 再對執行者 caspase 進行切割并使之激活，被激活的執行者 caspase對 caspase 靶蛋白進行水解，最終導致細胞的程序性死亡（圖 1.2）。在大多數生物體中，細胞凋亡是抵御病原菌、維持細胞正常穩態的重要生物學過程之一[65, 73]。細胞凋亡通常由兩種途徑引起，一種是 caspase-8 介導的外源性凋亡通路，另一種是 caspase-9 激活介導的內源性凋亡通路，兩者都能激活caspase-3[71,74,75]。然而，只有一部分病原體會被凋亡通路抑制其復制，而另一部分可能已經進化出一些防御和反應機制，不會受到凋亡的影響[73,76-79]。在無脊椎動物中。一些研究人員發現，蝦感染對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）之后，其體內的 caspase-3 基因的活性大幅增加[80]。比如墨吉明對蝦感染 WSSV 后，其caspase-3 基因表達水平有一定提升[81]；日本囊對蝦體內的 PjCaspase 基因在病毒感染后表達上調，被敲除后，其誘導的細胞凋亡受到明顯抑制[76]。據報道，經病原微生物感染后，蝦體中可檢測到大規模的細胞凋亡，這種凋亡的增加最終會導致蝦體的死亡[80, 82, 83]。一些研究證實，消除 caspase 活性可以減少細胞凋亡[84]，而 caspase-3 是細胞凋亡的重要調控元件[69]，所以敲除 Caspase-3 可能會提高蝦的存活率[79]。

第二章 克氏原螯蝦體內 Caspase-3C 基因的克隆與功能研究Fig. 2.1 (A-B) Nucleotide and deduced amino acid sequence of PcCaspase-3C from P. clarkii.Deduced amino acid residues are numbered on the right. Alow complexity region sequence isunderlined, and the CASc domain is in gray. The initiation codon (ATG) is marked in red. (C)Domain structure of PcCaspase-3C.標記。（C）PcCaspase-3C 的結構域示意圖。
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相關碩士學位論文 前1條

1 韓珂珂;克氏原螯蝦三個免疫相關基因Caspase-3C、Lectin和LGBP的功能研究[D];南京師范大學;2019年

本文編號：2886415