斑節對蝦(Penaeus monodon)具有味道鮮美、營養豐富、成長快等特點,目前為東南亞海域及中國南海海域重要養殖經濟水產種類。但近年來由于海洋環境污染日趨嚴重,水體微生物等物質經常嚴重超標,致使斑節對蝦的養殖產業發展因此受到嚴重影響。其中哈維弧菌是一種廣泛存在于海洋環境中可以感染甲殼類、魚類、貝類的條件致病菌,易引發突眼、慢性皮膚潰瘍、敗血癥等動物病癥,而細胞自噬可吞噬細菌或者病毒,對細胞免疫有重要的意義。在細菌與宿主互作中基因表達調控起非常重要的作用,miRNA是調控基因表達的重要因子,故研究miRNA調控細胞自噬基因在哈維弧菌刺激下的作用就很有意義。本實驗利用已構建的斑節對蝦轉錄組數據庫篩選出ATG5和ATG12 EST序列,用primer軟件設計特異性引物,PCR進行ORF驗證,利用RACE技術擴增得到ATG5和ATG12基因的3’末端,以此得到兩個基因的全長。確定了斑節對蝦ATG5和ATG12基因在不同組織中的表達分布規律;對靶向調控ATG5和ATG12的miRNA進行了篩選,并利用雙熒光素報告實驗進行了驗證;利用熒光定量PCR的方法及western blot免疫印跡等方法對ATG5、ATG12與miR-7562在哈維弧菌應激下的表達調控關系進行了研究,并初步對由哈維弧菌應激所產生的細胞自噬、miR-7562及ATG5-ATG12共軛系統之間關聯情況進行了鑒定,具體研究結果如下:(1)PmATG5基因序列cDNA主要為5’-UTR包含114 bp、1357 bp 3’-UTR和一個編碼269個氨基酸的810 bp開放閱讀框。PmATG5分子量為31.125 kDa,其理論等電點為5.66。PmATG12基因序列cDNA全長1101bp,包含363 bp的ORF,16 bp的5’-UTR和722 bp的3’-UTR。開放閱讀框編碼120個氨基酸,分子量為13.59 kDa,理論等電點為6.12。PmATG5和PmATG12在斑節對蝦各個組織中均有表達,在肌肉組織中表達量最高,且兩者的表達模式有一定的相似性。序列比對結果顯示,PmATG5氨基酸序列與藍蟹的ATG5一致性高達87%,PmATG12的序列則與家蠶有較高的一致性。表明兩者在進化上都高度保守,ATG5和ATG12對機體有十分重要的作用。(2)miRNA的篩選:靶基因預測使用的為mireap,miranda,targetscan三個軟件,miRNA靶基因預測的結果是取三個軟件的交集。從本實驗室已有的小RNA文庫篩選調控ATG5和ATG12的miRNA,共有22種miRNA調控ATG5,有24種miRNA調控ATG12,共同調控PmATG5和PmATG12基因的有三種,分別是mir-7562,mir-8485,mir-278。當斑節對蝦受到哈維弧菌刺激時,miR-278和miR-7562在6h和24h均有明顯的下調,PmATG5的相對表達量在72h達到最高,約為對照組的3.8倍,而PmATG12的相對表達量在哈維弧菌應激72h時達到最高,約為對照組的1.6倍,miRNA的表達與PmATG5和PmATG12表達呈負相關。雙熒光素報告結果顯示:miR-7562可以調控帶有ATG5 3’UTR的熒光素的表達(p0.0001);而在結合位點突變后,這種調控關系減弱(p=0.0022),減弱9.3%。由此證實miR-7562可能通過該結合位點調控熒光素的表達。miR-7562可以調控帶有ATG12 3’UTR的熒光素的表達(p0.0001);而在結合位點突變后,這種調控關系明顯減弱(p=0.0246),減弱46.2%。miR-7562可以調控帶有ATG5 3’UTR的熒光素的表達和ATG12 3’UTR的熒光素的表達。(3)miRNA通過調節ATG5、ATG12的轉錄水平介導細胞自噬。過量表達miR-7562可使PmATG5在24h和48h的相對表達量下調,約為對照組的0.67倍和0.81倍,可使PmATG12相對表達量明顯下調,在24h時約為對照組的0.62倍;沉默miR-7562可使PmATG5和PmATG12相對表達量上調,分別在24h顯著高于對照組2.2倍和1.43倍。免疫印跡結果顯示:過量表達miR-7562后,在48h斑節對蝦細胞自噬水平下降;沉默miR-7562后,在48h斑節對蝦細胞自噬水平明顯升高。(4)哈維弧菌刺激下,miR-7562調節的PmATG5和PmATG12在細胞自噬中的作用。熒光定量PCR結果顯示斑節對蝦受到哈維弧菌刺激后,過表達miR-7562(miR-7562-agomir)的斑節對蝦的PmATG5的相對表達量在24h與(V.harveyi+NCM)對照組相比明顯下調,而PmATG12相對表達量在注射6h和24h時與(V.harveyi+NCM)組相比表現下調,蛋白定量結果表明,斑節對蝦的細胞自噬較對照組相比在48h和72h明顯下調;沉默miR-7562(miR-7562-antagomir)的斑節對蝦的PmATG5在24h相對表達量與(V.harveyi+NCI)對照組比明顯上調,而PmATG12在注射6h和24h時與(V.harveyi+NCM)對照組相比相對表達量表現上調,蛋白定量結果表明,斑節對蝦在48h、72h細胞自噬程度較對照組明顯上調。在哈維弧菌刺激下,無論是干擾ATG5/ATG12單個基因的表達,還是同時干擾ATG5和ATG12的表達,細胞自噬水平較對照組都明顯下調。種種結果都表明,miR-7562調控的細胞自噬相關基因ATG5和ATG12在哈維弧菌刺激斑節對蝦下調控其細胞自噬。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S945.47
【部分圖文】：

圖 1-1 細胞自噬形成過程 自噬體伸長過程中，Atg5-Atg12 占據重要位置，從自噬體，自噬體膜不斷延長，至包裹并封閉鄰近的目標及胞漿，然后與溶酶體融合后吞噬物質δ兩類泛素共軛體系參與自噬體的擴，即 lc3-PE 和 ATG5-ATG12 共軛體Figure 1-1.The process of the formation of autophagy. ATG5 is one of the key players dautophagosome elongation. Starting from the autophagosome formation site, the autophagelongated, sealed around neighboring targets, and then fused with a lysosome to allowdegradation of the engulfed contents. Two ubiquitin-like conjugation systems are involveexpansion of autophagosome: ATG5-ATG12 and LC3-PE1.4 miRNA 簡介miRNA(microRNA)是近年來研究非常多的一類非編碼小 RNA（ncRN估計，miRNA 能夠在翻譯水平上調節人類基因組中高達 60%的基因編碼的由于 miRNA 在基因調控中的普遍作用，它們參與到許多生理過程，如分化

圖 2-5 PmATG12 系統進化樹δ使用 Clustal W 及 MEGA6 多重比對并建立 NJ 進化樹δ相關ATG12 GenBank 注冊號如下：黑脈金斑蝶 Danaus plexippus EHJ78946.1, 家蠶 Bombyx moriNP_001135963.1, 樺尺蛾 Biston betularia ADO32996.1, 斑馬魚 Danio rerio AAI54047.1, 美國短吻鱷 Alligator mississippiensis KYO48830.1, 斑胸草雀 Taeniopygia guttata ACH43616.1δFig.2-5 Phylogenetic analyses of PmATG12. Amino acid sequences alignment were producedby Clustal W, and we used the MEGA 6 to build neighbor-joining phylogeny tree. GenBankaccession numbers encoding ATG12 are as follows: Danaus plexippus EHJ78946.1, Bombyx moriNP_001135963.1, Biston betularia ADO32996.1,Danio rerio AAI54047.1, Alligatormississippiensis KYO48830.1, Taeniopygia guttata ACH43616.1。PmATG5 氨基酸序列顯示其與藍蟹（CAJ31266.1）的 ATG5 一致性高達 87%，與內華達古白蟻（KDR09853.1，61%），膜翅蜜蜂（KOX80344.1，59%）等也有很高的一致性(圖 2-6)。PmATG12 與家蠶（NP_001135963.1，71%）有較高的一致性，和樺尺蛾(ADO32996.1，65%)，斑胸草雀（ACH43616.1，60%）均有很高同源性（圖 2-6）。

di斑節對蝦與其他物種ATGS氛基酸多重比對，相關物種名稱和注冊號見圖2-5.Fig.2-6Multiplealignmentsofthededuceda
【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

1 段亞飛;董宏標;王蕓;劉青松;李華;張家松;;鰻弧菌感染對斑節對蝦免疫相關指標的影響[J];海洋科學;2015年09期

2 戴文婷;傅明駿;趙超;周發林;楊其彬;王艷;史進選;邱麗華;;斑節對蝦CDK2基因全長cDNA克隆及表達分析[J];南方水產科學;2015年02期

3 熊勵晶;童煜;毛萌;;細胞自噬治療細菌感染的潛在價值[J];生命的化學;2011年06期

4 郭旭光;夏勇;馬越云;郝曉柯;;肺上皮細胞自噬體在結核分枝桿菌感染中保護作用的分子機制[J];現代生物醫學進展;2011年21期

5 郭旭光;馬越云;周珊;劉家云;蘇明權;郝曉柯;;肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬體與結核分枝桿菌相互作用的研究[J];現代生物醫學進展;2010年05期

6 楊其彬;葉樂;溫為庚;王雨;江世貴;;鹽度對斑節對蝦蛻殼、存活、生長和飼料轉化率的影響[J];南方水產;2008年01期

7 黃建華;馬之明;周發林;葉樂;江世貴;李色東;;池塘養殖斑節對蝦的生長特性[J];海洋水產研究;2006年01期

8 陳昌福,姚鵑,陳萱,李兆文,陳超然,梁運祥;口服免疫多糖(酵母細胞壁)對南美白對蝦抗哈維弧菌感染的作用[J];安徽農業大學學報;2004年04期

本文編號：2892206