目的:目前已有研究證實與正常孕婦相比,子癇前期孕婦外周血胎盤源性微囊泡(placental-derived microvesicles,pcMVs)水平明顯升高。同時文獻研究采用胎盤絨毛組織機械震蕩、絨毛組織體外培養(yǎng)和胎盤子葉灌注三種不同方法制備胎盤源性微囊泡進行體外實驗,發(fā)現(xiàn)胎盤源性微囊泡可能與內(nèi)皮細胞功能障礙、炎癥反應和凝血纖溶失衡有關(guān)。本實驗在上述三種制備方法的基礎(chǔ)上,以及參考腦源性微囊泡的制備方法,采用凍存絨毛組織研磨法制備胎盤源性微囊泡,并且與重度子癇前期孕婦外周血微囊泡進行對比鑒定,觀察兩者在形態(tài)以及功能活性的差異。探討建立一個改良型制備方法,利于體外實驗進行胎盤源性微囊泡與子癇前期發(fā)病機制相關(guān)性研究。方法:1)正常孕婦剖宮產(chǎn)時取胎盤組織,采用免疫組織化學法鑒定選取的樣本組織為絨毛組織;2)胎盤絨毛組織采用組織勻漿器研磨分步離心的方法體外制備pcMVs,同時抽取重度子癇前期孕婦外周血分步離心的方法體外制備外周血微囊泡;3)用透射電鏡、流式細胞儀和Nanosight方法鑒定所得的研磨法pcMVs和外周血微囊泡的形態(tài)學及表型;4)用半自動凝血儀TS6000,體外檢測研磨法pcMVs和外周血微囊泡兩組的凝血酶原時間(Prothrombin time,PT),比較促凝活性;5)應用Transwell小室系統(tǒng)檢測研磨法pcMVs和外周血微囊泡穿透人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的能力;6)應用離子電導顯微鏡觀察研磨法pcMVs和外周血微囊泡兩組分別對HUVEC之間的細胞連接以及細胞形態(tài)的影響。結(jié)果:1)免疫組織化學法結(jié)果顯示胎盤組織能表達合體滋養(yǎng)細胞的特異性標記物---胎盤堿性磷酸酶,證實選取部位的組織為絨毛組織;2)胎盤絨毛組織研磨制備的pcMVs和子癇前期外周血離心制備的微囊泡在透射電鏡下觀察均具有膜結(jié)構(gòu);3)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示胎盤研磨法制備的pcMVs能表達大量的合體滋養(yǎng)細胞特異性標記物,而基本不表達血小板、紅細胞、白細胞和內(nèi)皮細胞的標志物。子癇前期孕婦外周血微囊泡也能表達合體滋養(yǎng)細胞特異性標記物,少部分表達血小板、紅細胞、白細胞標志物和基本不表達內(nèi)皮細胞的標志物;4)Nanosight結(jié)果顯示兩組制備的微囊泡的粒徑范圍大都在100-500nm之間;5)促凝實驗中,與PBS溶劑對照組相比,胎盤研磨法pcMVs和子癇前期孕婦外周血微囊泡組的凝血酶原時間(Prothrombin time,PT)均明顯縮短(p0.001),顯示兩組制備的微囊泡均具有促凝活性,而與外周血微囊泡組相比,胎盤研磨法pcMVs的PT值明顯縮短(p0.001);6)兩組微囊泡均能穿透HUVEC,并且研磨法pcMVs穿透能力高于外周血微囊泡;7)胎盤pcMVs能破壞HUVEC之間的連接,增大細胞間的縫隙,并且引起內(nèi)皮細胞形態(tài)改變,細胞高度明顯增加;外周血微囊泡也能破壞細胞連接,使內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)論:1)通過胎盤絨毛組織研磨分步離心的方法在體外成功大量制備了微囊泡,具有完整的膜結(jié)構(gòu)、能高表達滋養(yǎng)細胞特異性標記物并且直徑大小范圍符合微囊泡定義,并且與子癇前期外周血微囊泡形態(tài)特征相符合;2)體外利用研磨法制備的胎盤pcMVs具有促凝活性,并且會引起內(nèi)皮細胞通透性增加,損害內(nèi)皮細胞等功能活性,為后續(xù)研究pcMVs與子癇前期發(fā)病機制相關(guān)性提供了充足的原料。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R714.244
【部分圖文】：

(1) 將離心所得研磨法 pcMVs 和外周血微囊泡的重懸液分別稀釋 50 倍和 20 倍充分混勻后使用 1ml 無菌注射器導入納米顆粒分析儀中，在屏幕上觀察布朗運動。(2) 之后可在納米顆粒分析儀的屏幕上觀察到微囊泡的布朗運動，然后對其結(jié)果直接進行分析。1.1.6.2 實驗原理NanoSight 納米顆粒分析儀主要運用光散射的原理和微囊泡的布朗運動，反映所測樣本液體中微囊泡。當激光束照射到微囊泡表面時，就會使激光束發(fā)生散射，然后通過顯微鏡清晰地觀察到囊泡，并且可用顯微鏡記錄下微囊泡的布朗運動，進而分析所測微囊泡樣本液的粒徑分布曲線。1.2 結(jié)果1.2.1 免疫組織化學法鑒定選取樣本組織選取樣本組織的陽性組能大量表達 PLAP（圖 1A），證明選取的組織包含有合體滋養(yǎng)細胞；PBS 溶劑空白對照組則不表達（圖 1B）。

于 0.1μm 的區(qū)域，用來確定微囊泡的大小以及位置(圖 2.1A)。其中圖 2.1.B 所示 P1 區(qū)域即為微囊泡的區(qū)域，橫縱坐標 FSC 和 SSC 均采用對數(shù)刻度。選定 P1門，進入下一個散點圖（圖 2.1C），橫坐標為 PE 熒光素結(jié)合的 PS 的標記 AnnexinV，縱坐標為 FITC 熒光素結(jié)合的合體滋養(yǎng)細胞的標記物 PLAP，橫坐標和縱坐標均采用對數(shù)刻度。最后應用購買的 AccuCount Ultra-Rainbow FluorescebntParticles（濃度 beads），根據(jù)濃度濃度 beads 在 FSC/PerCP 散點圖（圖 2.1D）生成的圖形，來圈定濃度微粒的位置，根據(jù)公式（收集微囊泡總數(shù)*500）/（收集濃度 beads 數(shù)*樣本體積）=樣品微囊泡的濃度（個/μl），計算所測微囊泡的濃度。胎盤研磨法 pcMVs 測定的流式管中，根據(jù) FITC-PLAP 的同型對照和PE-Annexin V+EDTA 對照管（圖 2.2B）劃定 FITC-PLAP 陽性的區(qū)域（Q1-1+Q2-1象限）和 PE-Annexin V 陽性區(qū)域（Q4-1+Q2-1 象限），圖 2.2C 中 Q2-1 象限則為FITC-PLAP 和 PE-Annexin V 雙陽性區(qū)域。子癇前期孕婦外周血微囊泡測定的流式管中，圖 2.2Ⅱ為 PLAP 的同型對照和 PE-Annexin V+EDTA 對照管，圖 2.2C中 Q2-1 象限也是 FITC-PLAP 和 PE-Annexin V 雙陽性區(qū)域。

圖 1.2.2 A 和Ⅰ：胎盤研磨法 pcMVs 組和子癇前期孕婦外周血微囊泡組的陰性對照管；B 和Ⅱ：胎盤研磨法 pcMVs 和子癇前期孕婦外周血微囊泡FITC-PLAP 的同型對照；C 和Ⅲ：胎盤研磨法 pcMVs 和子癇前期孕婦外周血微囊泡 FITC-PLAP/PE-Annexin V 陽性區(qū)域 Q2-1按照 P2 區(qū)域， 1g 胎盤絨毛組織研磨離心 1ml PBS 重懸然后稀釋 10 倍，按照低速 60s 上機所得的微囊泡濃度為 2-4*106個/μl，而 20ml 子癇前期孕婦外周血超離 200μl 重懸后，同樣按照低速 60s 上機所測得微囊泡的濃度為 1-4*106個/μl。我們對比研磨法 pcMVs 組和外周血微囊泡組 FITC-PLAP 陽性率，結(jié)果顯示胎盤研磨法 pcMVs 的 FITC-PLAP 陽性率為 88.6%±2.4%，外周血微囊泡FITC-PLAP 陽性率為 57.3%±2.1%，胎盤研磨法 pcMVs 組和外周血微囊泡組PE-Annexin V 陽性率分別為 4.2%±0.8%、 3.3%±1.2%。1.2.2.2 研磨法 pcMVs 和外周血微囊泡兩組中血小板、紅細胞、白細胞、內(nèi)皮細
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本文編號：2887150