前言肌腱病(tendinopathy)是一種慢性勞損性疾病,病因尚不清楚,普遍認為與肌腱的過度使用直接相關[1]。肌腱持續承受壓力和機械負重,不僅能導致急性肌腱損傷而且會引發慢性降解性肌腱病。跟腱,髕骨,肩袖、前臂擴展肌、肱二頭肌、脛骨后肌處的肌腱是最易引發肌腱病的部位。肌腱干細胞(Tendon stem cells,TSCs)是一種肌腱腱旁組織來源的間充質干細胞。James H-C Wang和M.de Mos等人研究發現:肌腱干細胞在特定的環境下可以進一步分化為肌腱細胞,且較肌腱細胞而言,肌腱干細胞不僅更能促進細胞的增殖和膠原合成,還能分泌更多的細胞外基質修復損傷的肌腱。肌腱干細胞具有多向分化潛能,在一定條件下能夠分化成脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞[2-7],在肌腱修復過程中,肌腱干細胞的這種多向分化潛能將發揮重要作用。然而,目前肌腱干細胞的分化機制尚不清楚,研究證實,TSCs在肌腱組織修復方面存在明顯的優勢。肌腱干細胞來源豐富,肌腱組織含有1%-4%的TSCs;TSCs體外培養增殖能力更強,擁有更短的培養周期,多次傳代后仍能保持穩定的干細胞特性[8];TSCs趨向軟組織,故其向肌腱、軟骨、骨組織的分化趨勢更容易;肌腱干細胞免疫原性極低,肌腱干細胞甚至還有免疫抑制性[9]。所以,在肌腱損傷修復方面,肌腱干細胞潛力巨大,前景光明。因此,如何對肌腱干細胞分化方向加以調控,使其向有利于肌腱損傷恢復的方向分化,為肌腱病的治療指明了新的方向。前人的研究表明前列腺素(PGE2)在肌腱損傷中是疼痛和急性炎癥反應的主要炎癥調節因子[10,11]。在動物模型中,重復的機械負重會使肌腱中PGE2的表達顯著增加,PGE2的增加可以看做是對重復性的負重的反應。前列腺素E2處理肌腱干細胞后,其增殖能力明顯降低,不同濃度的PGE2處理肌腱干細胞不同時間,其將向成骨和成脂兩種不同的方向分化[5,12]。正常肌腱的腱-骨連接部分有四種不同的組織:肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨及骨。在肌腱損傷修復過程中,肌腱干細胞向軟骨和成骨方向的分化是有利于的。而損傷的肌腱中脂肪組織的積累則不利于肌腱病的恢復。因此,如何調控損傷的肌腱中肌腱干細胞的成骨分化和脂質積累,是將肌腱干細胞應用于治療肌腱病的關鍵所在。Sirtuin是生命體中廣泛存在的一類依賴于NAD+的組蛋白去乙酰化酶,Sirt1是目前研究最為廣泛的sirtuin蛋白,它在能量代謝和細胞分化過程中起著重要的作用[13]。sirt1通過自身的去乙酰化活性發揮其調節作用,其中組蛋白的去乙酰化是sirt1調節細胞分化的主要機制[14]。在細胞分化中多種非組蛋白也是sirt1的靶標,研究顯示,sirt1將runx2和β-catenin[15]去乙酰化,來調節間充質干細胞的成骨分化[16]。ppar?在間充質干細胞成骨成脂分化平衡中起著重要作用[17,18]。白藜蘆醇能促進間充質干細胞的成骨分化[19,20]。同樣被激活的sirt1能夠減少脂肪細胞數目,增加成骨分子標記的表達,而sirt1被抑制后,則會增加脂肪細胞數目和成脂分子標記,減少成骨分子標記的表達,因此被激活sirt1起到抑制成脂分化促進成骨分化的作用[21]。sirt1在細胞分化中的作用及其調控機制,為我們的課題指明了方向。肌腱病在運動醫學中是一種高發病,目前臨床普遍采取抗炎治療,通過減少炎性因子pge2達到減輕肌腱及腱周疼痛的目的。近年來自體肌腱干細胞治療自體肌腱病逐漸成為運動醫學醫生關注的重點。肌腱干細胞具有多項分化潛能,可以正常分化成肌腱,也可以異常分化成骨、成脂,如何調控其異常分化是肌腱病早期康復的關鍵。在骨髓間充質干細胞中,sirt1是骨系及脂系分化的重要因子,因此,本課題研究炎性因子pge2刺激下導致的肌腱病通過sirt1的調控抑制成脂和成骨促進成肌腱來達到治療肌腱病的目的,為臨床提供治療肌腱病的新方法。綜上所述,本研究主要在前期工作的基礎上,檢測pge2處理前后的肌腱干細胞其成骨分化能力的改變,并探求其相關的信號通路;構建bmp-2,igf-1,cebpδ,crebandsmad1穩定低表達的細胞模型,探討pge2處理前后的肌腱干細胞其成脂分化能力的改變,及其可能影響成脂分化的相關信號通路;從基因和蛋白水平檢測sirt1激活劑和抑制劑處理不同時間后肌腱干細胞中sirt1的表達情況,并檢測處理前后細胞中成骨和成脂的變化,研究sirt1對肌腱干細胞成骨和成脂分化的調控,從而闡明其機制,為肌腱病的發生、發展機制以及生物學治療提供理論依據,最終達到治療肌腱病的目的。方法第一部分:分離培養大鼠的肌腱干細胞,并用細胞免疫熒光的方法鑒定肌腱干細胞,檢測細胞的標記蛋白的表達;分別用不同濃度的pge2處理肌腱干細胞7天或者用100ng/ml的pge2分別作用1天、3天、7天、14天時,茜素紅染色、堿性磷酸酶染色以及油紅染色檢測處理前后肌腱干細胞中成骨、成脂能力的變化,并通過elisa方法、realtimepcr、westernblot從基因和蛋白水平檢測處理前后細胞中bmp2以及成脂基因pparγ的表達;不同濃度的pge2處理大鼠肌腱干細胞7天誘導肌腱干細胞的成脂分化,分別用實時定量pcr方法和elisa從基因和蛋白水平檢測肌腱干細胞中igf-1的表達。在pge2處理的肌腱干細胞組中加入mek的抑制劑u0126(10um)、pi3k的抑制劑ly294002(20um)以及akt抑制劑iv(10um),通過免疫印跡的方法分別檢測處理前后肌腱干細胞中磷酸化的erk和磷酸化的akt的表達水平。在肌腱干細胞的培養基中加入bmp2(200ng/ml),分別作用1天、3天、7天和14天后,茜素紅和堿性磷酸酶檢測肌腱干細胞的成骨能力。分別構建bmp-2,igf-1,cebpδ,crebandsmad1穩定低表達的細胞系,檢測基因轉染前后及pge2處理前后bmp-2,igf-1,camp,pka,cebpδ,smad1的表達。第二部分:分別檢測不同濃度的pge2刺激肌腱干細胞不同時間后,細胞中sirt1的表達。并分別用0.2um和0.4um的sirt1的激活劑srt1720處理肌腱干細胞后,從基因和蛋白水平檢測肌腱干細胞中sirt1的表達量,同時用0.4um的sirt1的激活劑和0.2um的sirt1的抑制劑分別處理3天、7天、10天、14天后,從基因和蛋白水平檢測肌腱干細胞中sirt1的表達量以及成骨相關指標bmp2、runx2和成脂相關指標pparγ的表達,茜素紅和油紅染色檢測細胞成骨成脂分化能力的變化。分別用0.4um的sirt1的激活劑srt1720和0.02um的sirt1的抑制劑ex527處理肌腱干細胞,從基因和蛋白水平檢測肌腱干細胞中成骨相關通路sirt1/β-catenin/runx2以及成脂相關通路pi3k/akt/cebp?/ppar?的變化。將100ng/ml的pge2注射到大鼠跟腱腱鞘內,處理4周,構建大鼠肌腱病模型。用0.4um的sirt1激活劑srt1720處理大鼠左側跟腱,10天后,he染色觀察大鼠跟腱組織成骨成脂分化情況。結果第一部分:隨著處理時間的延長,肌腱干細胞的成骨能力逐漸增強,當處理14天時,肌腱干細胞的成骨能力最強,同時bmp2激活了下游信號通路smad1,5,8的磷酸化。pi3k的抑制劑ly294002以及akt抑制劑iv不能抑制由bmp2激活的smad的磷酸化,卻可以減低runx2的表達并抑制肌腱干細胞的成骨分化能力,mek的抑制劑u0126無上述功能。pi3k/akt信號通路參與到bmp2誘導的肌腱干細胞的成骨分化。隨著pge2處理時間的延長和處理濃度的不斷增高,肌腱干細胞的成脂分化能力逐漸增強,成脂基因pparγ的表達也逐漸增高。pge2促進了肌腱干細胞的成脂分化。不同濃度的bmp2處理大鼠肌腱干細胞7天或者是用100ng/ml的pge2分別處理細胞3天、7天、10天后,我們發現bmp2單獨存在時不能直接介導pge2誘導的成脂分化。隨著pge2濃度的增加,處理時間的延長,肌腱干細胞中igf-1的表達逐漸增高。igf-1與pge2之間存在著時間依賴關系和劑量依賴關系。當沒有bmp2存在,僅僅是IGF-1單獨作用,不能介導PGE2誘導的成脂分化。然而,BMP2和IGF-1共同存在時能夠介導PGE2誘導的成脂分化。PGE2或者是IGF-1+BMP-2處理細胞后,細胞中的Smad和CREB被激活,發生了磷酸化。PGE2或者是IGF-1,而不是BMP-2,促進了CREB的磷酸化,當CREB的基因被干擾后,細胞中的IGF-1的表達下調。第二部分:100ng/ml的PGE2分別作用1天、3天、7天、10天發現,肌腱干細胞中有sirt1的表達,且sirt1的表達量隨著PGE2濃度的增高而增高,隨著PGE2處理時間的延長而延長。且隨著sirt1的激活劑SRT1720濃度的增加,不管是基因水平還是蛋白水平,細胞中sirt1的表達增加,處理14天時,表達最高;細胞中成骨指標BMP2.Runx2的表達逐漸增高,成骨能力逐漸增強,細胞中成骨相關通路β-catenin.Runx2的表達逐漸增高,第10天時最高,隨后,表達逐漸減低;而成脂相關指標PPARγ的表達逐漸降低,成脂能力逐漸減弱,成脂相關通路PI3K/AKT/CEBP?/PPAR?的表達逐漸降低,第10天時最低,隨后,表達逐漸升高。同樣的,隨著sirt1的抑制劑EX527濃度的增高處理時間的延長,細胞中sirt1的表達降低,第14天時,表達最低;細胞中成骨指標BMP2、Runx2的表達逐漸降低,第10天時最低,隨后,表達逐漸升高;而成脂相關指標PPARγ的表達逐漸升高,第10天時最高,隨后,表達逐漸減低。100ng/ml的PGE2注射到大鼠跟腱腱鞘內,處理4周,HE染色觀察到肌腱及腱周出現異位骨化和脂肪小滴的形成,證明本課題組成功構建了大鼠肌腱病模型。當0.4um的sirt1激活劑SRT1720處理大鼠左側跟腱,觀察10天后,HE染色顯示肌腱病的病理情況得到明顯改善。結論第一部分:PGE2通過PI3K-Akt信號通路促進了肌腱干細胞的成骨分化。IGF-1和BMP2共同作用促進了了PGE2介導的TSCs的成脂分化。IGF-1和BMP2分別激活了下游的CREB和Smad的磷酸化,從而進一步使成脂基因PPARγ2的表達上調,最終促進了肌腱干細胞的成脂分化。第二部分:肌腱干細胞中發現了sirt1的表達,且Sirt1通過SIRT1/β-catenin/Runx2通路影響了肌腱干細胞的成骨分化,通過PI3K/AKT/CEBP?/PPAR?通路影響了肌腱干細胞的成脂分化。動物模型證實了依賴濃度依賴時間的sirt1激活劑可以抑制肌腱干細胞的成骨和成脂分化。
【學位單位】：第三軍醫大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R686.1
【文章目錄】：
縮略詞表
英文摘要
中文摘要
第一部分
    （一）前列腺素(PG)E2誘導肌腱干細胞成骨分化的機制研究
        1.1 前言
        2.1 材料和方法
        2.2 結果
        2.3 討論
        2.4 結論
    （二）前列腺素(PG)E2誘導肌腱干細胞成脂分化的機制研究
        1.1 前言
        2.1 材料和方法
        2.2 結果
        2.3 討論
        2.4 結論
第二部分 Sirt1調控肌腱干細胞成骨成脂分化的機制研究
    1.1 前言
    2.1 材料和方法
    2.2 結果
    2.3 討論
    2.4 結論
本研究創新性的自我評價
參考文獻
文獻綜述 肌腱干細胞的分子生物學研究進展及其在肌腱病中的應用
    參考文獻
在讀期間發表論文情況
致謝

【參考文獻】

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1 劉穎,陸一帆,楊少鋒;運動對大鼠骨骼肌廢用性萎縮的恢復及血清雄激素水平的影響[J];中華物理醫學與康復雜志;2001年03期

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1 方小芳;火針對跟腱末端病大鼠組織中IL-1β、IL-6及iNOS影響的研究[D];首都體育學院;2010年

本文編號：2849022