【摘要】：法布雷疾病(Fabry disease;FD),是因GLA基因編碼的α-半乳糖苷酶A缺失或完全喪失而導致的糖鞘脂類底物積累的先天性X連鎖隱性遺傳病。其發(fā)病癥狀隨底物在患者體內(nèi)積累部位的不同而異。男性患者發(fā)病嚴重,女性多為攜帶者且癥狀較輕。本課題為了進一步研究GLA基因突變導致FD的分子機制,構(gòu)建了GLA野生型及突變體的細胞模型,并對新發(fā)突變位點進行了致病性研究,同時對突變體的結(jié)構(gòu)及功能做了詳細分析。1.首先對5個FD先證者進行了GLA基因的Sanger測序,確定突變位點分別為:c.119CA、c.101AG、c.680GC、c.801+1G㧐A和c.280T㧐C,分析各個突變的研究進展,發(fā)現(xiàn)c.801+1G㧐A和c.280T㧐C兩個突變位點為新發(fā)突變。因此,本研究主要圍繞GLA基因突變c.801+1G㧐A和c.280T㧐C的致病機制進行研究。2.利用qRT-PCR技術(shù)檢測患者血液中GLA基因mRNA的表達量。與正常人相比,患者體內(nèi)GLA基因的表達量都有所下調(diào)且含有c.801+1G㧐A突變的患者下調(diào)更多。由于c.801+1G㧐A突變位點位于Intron 5第一位,可能影響前體mRNA的剪接。利用RT-PCR技術(shù)檢測患者體內(nèi)GLA基因的轉(zhuǎn)錄本。研究表明,患者體內(nèi)除正常轉(zhuǎn)錄本外,還存在一個分子量較大的轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)測序分析,該轉(zhuǎn)錄本是在Exon 5和Exon6之間插入了36 bp的Intron 5所致;為了進一步闡明剪接異常是否由該突變導致,我們利用minigene技術(shù)轉(zhuǎn)染HEK293T細胞來研究該突變對minigene基因轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)果在mRNA水平和蛋白水平均證明c.801+1G㧐A突變可以引起GLA基因mRNA的異常剪接。3.利用生物信息學、生物化學及細胞生物學的方法對突變體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能做進一步研究。通過序列同源性比對發(fā)現(xiàn),這兩個突變位點在不同物種中都高度保守;同源建模分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),c.801+1G㧐A(p.L268IfsX3)突變導致GLA酶活性區(qū)域嚴重受損,部分Domain 1(氨基酸殘基269-330)及全部Domain 2(氨基酸殘基331-429)的結(jié)構(gòu)丟失;c.280 T㧐C(p.C94R)突變緊鄰酶活性位點D92和D93,可能影響該酶與底物的結(jié)合,而且突變導致C94與C52形成的二硫鍵斷裂,影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。4.構(gòu)建GLA-WT及GLA-MT的真核表達載體,通過細胞轉(zhuǎn)染,免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),GLA c.801+1G㧐A突變體蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)形成聚集體,并且呈斑點狀不均勻分布。另外,與GLA-WT轉(zhuǎn)染的細胞相比,c.801+1G㧐A突變體可以加速細胞衰老;c.280 T㧐C突變體在細胞內(nèi)的定位雖無明顯改變,但可導致細胞核發(fā)生皺縮;α-半乳糖苷酶酶活性分析顯示,與GLA-WT相比,這兩個突變體的酶活性均發(fā)生下調(diào),且GLA c.801+1G㧐A突變體的酶活性下降更為顯著。綜上所述,本研究以法布雷患者血液為研究材料,利用Sanger測序技術(shù)檢測到兩個GLA基因的兩個新發(fā)突變,應用生物信息學、分子生物學、生物化學及細胞生物學手段找到基因突變引起患者發(fā)病的分子機制,該研究成果將進一步豐富Fabry disease突變數(shù)據(jù)庫并為FD的臨床精確診斷提供理論依據(jù)。
【圖文】：

實驗結(jié)果家系 1: 先證者Ⅲ-3 存在突變位點 c.119C>A，患者姐姐Ⅲ-6 及外甥Ⅳ-2 也攜突變位點。基因突變后，第 40 位的氨基酸由脯氨酸（P）突變?yōu)榻M氨酸（H位點 P40 位于蛋白質(zhì) Domain1 酶活性區(qū)域，位于α螺旋結(jié)構(gòu)末端位置，與氨262 組裝且包埋于三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部。該突變已于 2000 年被報道[33]（HGMD ID003742）Clinver 數(shù)據(jù)庫對其致病性預測給出一顆星（Variation ID：92539）。TTCTTTGGCCCGCCGCCCCCGCCGGAAGGCTACAAGTGCCTCGCCTCCTCCCAGGAACTTTACGTCCCGCTTTAAGAATGTTTCCTCCTCT CGTCCCGCGACAAAGTTGGTATTGCGCCGCCCCCGCCGTGAATGCCAAACTAACAGGCCCCCGCCCGAGAAAAAGGTGGAC

GLA 新突變的鑒定及其引起法布雷病的機制研究家系 2: 先證者Ⅱ-1 及姐姐Ⅱ-3 的測序結(jié)果經(jīng)比對分析后發(fā)現(xiàn)存在 GLA 基因突變 c.101A> G， 編碼蛋白質(zhì)的氨基酸第 34 位由天冬酰胺(N)突變?yōu)榻z氨酸(S)，，該突變在 1993 年已被報道（HGMD ID CM930324）。Clinver 數(shù)據(jù)庫對此位點判斷為致病，預測給出 2 顆星（Variation ID：10724）。N34 包埋在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)第一個單體 1.7 的位置。氨基酸殘基 N34 與 D224 分別位于氫鍵兩端，對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有很大作用。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R596;Q78

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本文編號：2627798