背景和目的： 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已經(jīng)成為全球發(fā)病率最高的致死性心臟疾病，其病理變化往往是在冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化的基礎(chǔ)上繼發(fā)急性血栓，致使冠狀動(dòng)脈血供急劇減少甚至血流中斷，造成相應(yīng)的供血心肌持久而嚴(yán)重地急性缺血，從而引起大量心肌細(xì)胞死亡。目前，臨床上廣泛開(kāi)展的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）能夠快速恢復(fù)急性缺血心肌的血液灌注，最大程度地挽救瀕臨死亡的心肌細(xì)胞，是限制心肌梗死面積、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵，也已成為急性心肌梗死的最佳治療策略。但是，在急性心梗的搶救和治療過(guò)程中，罪犯血管重新恢復(fù)血液供應(yīng)后，過(guò)量的自由基等攻擊重新獲得血液供應(yīng)的這部分組織內(nèi)的細(xì)胞，會(huì)造成進(jìn)一步的再灌注損傷，臨床表現(xiàn)為：心肌頓抑、再灌注性心律失常、微循環(huán)障礙及致死性再灌注損傷。這些損傷會(huì)導(dǎo)致左心室收縮功能減弱、左室內(nèi)壓降低等心肌功能的抑制。 目前，缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未完全明確。已有眾多學(xué)者分別進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，許多研究均從不同方面減輕了再灌注損傷，得出了令人鼓舞的結(jié)論，另外，分子水平領(lǐng)域的相關(guān)機(jī)制研究仍在繼續(xù)，這也將有助于人們發(fā)現(xiàn)新的缺血再灌注保護(hù)介質(zhì)。 促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由缺氧誘導(dǎo)因子家族誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子超家族成員。氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素(carbamylatederythropoietin，CEPO)是促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)的一種衍生物。EPO和CEPO通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、抗凋亡、促血管生成、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、刺激心肌細(xì)胞增殖分化在心、腦組織缺血缺氧時(shí)起到了重要的保護(hù)作用。除了經(jīng)典的造血功能以外，EPO和CEPO對(duì)整個(gè)生物體穩(wěn)態(tài)的維持也發(fā)揮著重要的作用。EPO作為一種促血管生成因子，直接參與創(chuàng)傷愈合、月經(jīng)周期、炎癥、腫瘤、視網(wǎng)膜病變等生理性和病理性新生血管形成，并且具有與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相當(dāng)?shù)男?yīng)。EPO直接或通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。EPO與其受體結(jié)合可以促進(jìn)新生血管形成。作為EPO的新一代高效能衍生物，CEPO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用如何是本課題研究的主要內(nèi)容。 目前關(guān)于CEPO的相關(guān)研究仍然較局限于動(dòng)物試驗(yàn)領(lǐng)域，在急性心肌梗死PCI術(shù)后即心肌缺血再灌注損傷病人中的應(yīng)用鮮有報(bào)道，利用此類患者的血清攻擊血管內(nèi)皮細(xì)胞造成細(xì)胞損傷模型的研究尚不多見(jiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞做為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)中充分模擬臨床病理生理過(guò)程，采用血清藥理學(xué)的方法建立細(xì)胞損傷模型，從而觀察CEPO的保護(hù)作用，并對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 方法： 本研究以ECV340內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，分別給予以PCI手術(shù)后12h、24h、48h和72h的患者血清，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血清分別作用24h和48h，采用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期，放免法測(cè)定NO含量和NOS活性，ELISA法檢測(cè)IL-1、IL-6等炎癥因子含量，篩選PCI術(shù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的高峰時(shí)間和細(xì)胞作用時(shí)間。后加入不同濃度的EPO（100IU/ml、50IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、1IU/ml）和不同濃度的CEPO（100IU/ml、50IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、1IU/ml)。采用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期，放免法測(cè)定NO含量和NOS活性，ELISA法檢測(cè)IL-1、IL-6等炎癥因子含量，篩選EPO及CEPO對(duì)PCI術(shù)后患者血清致ECV304細(xì)胞損傷的保護(hù)作用最佳濃度。EPO和CEPO對(duì)ECV304細(xì)胞損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究則以生化法檢測(cè)EPO和CEPO對(duì)LDH泄漏率的影響； Westernblotting analysis檢測(cè)JAK2及其磷酸化蛋白含量；免疫組化法分別檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中pERK、pJNK、pP38的含量。 結(jié)果： 1、與陰性對(duì)照組相比，分別用PCI術(shù)后12h、24h、48h和72h患者血清處理ECV304細(xì)胞24h和48h后，凋亡率非常顯著性增加（P0.01）；G0/G1期、G2/M期細(xì)胞所占比例顯著降低，S期G2/M期增加（P0.05或P0.01）。 2、與陰性對(duì)照組相比，分別用PCI術(shù)后12h、24h、48h和72h患者血清處理ECV304細(xì)胞24h和48h后，，NO含量顯著降低，NOS活性顯著減弱（P0.05或P0.01），IL-1和IL-6含量均非常顯著增加（P0.01），以48h患者血清處理ECV304細(xì)胞24h后，效果最為顯著。 3、與空白對(duì)照組相比，采用1IU/ml-100IU/ml EPO給藥后，吸光度值均非常顯著性增加（P0.01），其中以50IU/ml EPO效果最為顯著。 4、采用I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO給藥后，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P0.05或P0.01））；采用20I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO給藥后，S期細(xì)胞所占比例顯著降低（P0.05或P0.01），采用50U/ml CEPO給藥后G2/M期降低（P0.01）。 5、采用I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO給藥后，NO和NOS含量顯著增加（P0.05或P0.01）），IL-1和IL-6顯著降低（P0.05或P0.01）），其中以CEPO20IU/ml及EPO50IU/ml效果最為顯著。 6、與模型組相比，采用50IU/ml EPO或20IU/ml CEPO給藥后，LDH泄漏率非常顯著性降低（P0.01）。 7、與模型組相比，JAK2和P-JAK2的表達(dá)水平明顯降低。 8、與模型組相比，EPO及CEPO處理后pERK、pJNK、pP38的陽(yáng)性表達(dá)水平顯著降低（P0.01）。 結(jié)論： 1、用PCI術(shù)后12h、24h、48h和72h患者血清處理ECV304細(xì)胞可成功建立經(jīng)PCI術(shù)后患者血清誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型； 2、48h患者血清處理ECV304細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡最為顯著，內(nèi)皮損傷最為明顯； 3、EPO處理ECV304細(xì)胞24h后，可促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖，以EPO50IU/ml效果最為顯著；而CEPO并不促進(jìn)正常內(nèi)皮細(xì)胞增殖； 4、CEPO也可有效緩解PCI術(shù)后患者血清造成的細(xì)胞損傷，以CEPO20IU/ml效果最為顯著； 5、CEPO可降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)，顯著增加NO和NOS含量，顯著降低IL-1和IL-6； 6、CEPO可降低JAK2及p-JAK2表達(dá)，提示CEPO可通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT5信號(hào)通路發(fā)揮心血管保護(hù)作用；CEPO可降低pERK、pJNK、pP38表達(dá)，提示CEPO可通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路發(fā)揮心血管保護(hù)作用。



本文編號(hào)：1715713