成纖維細胞生長因子同源性因子(Fibroblast growth factor homologous factors,FHFs),包括FGF11-FGF14,是一類新發現的電壓依賴性鈉通道(voltage gated sodium channel,Nav通道)結合蛋白,可通過調節Nav通道的表達和功能來調節組織和細胞的興奮性。Nav通道在可興奮細胞的興奮性、傳導性上具有重要作用,在心臟,Nav通道異常與多種心律失常的發生密切相關。如前期的研究發現FGF14突變或FGF12/FGF14基因敲除小鼠可引起家族遺傳性脊髓小腦運動失調癥等神經系統疾病,我們最近的研究發現FGF13在鼠類心肌組織中也有明顯的表達,且可調節心肌Nav通道的功能以及興奮性的傳導,但目前并無證據證明FHFs與心律失常的發生直接相關,與哪類心律失常相關。為回答此科學問題,本課題通過制備FGF13心肌條件性基因敲除小鼠動物模型,直接在整體動物水平檢測敲除FGF13對心肌電活動的影響以及是否發生心律失常,并通過觀測敲除FGF13對心肌動作電位特征以及鈉電流的影響來發現其可能的細胞電生理學機制,此研究將為揭示FHFs在心律失常中的作用及其機制提供重要的實驗資料。第一部分獲得FGF13心肌條件性基因敲除小鼠目的:(1)獲得FGF13心肌條件性基因敲除小鼠。(2)評價此基因敲除小鼠在心肌組織中FGF13基因的敲除效果。方法:(1)應用電轉法,southern雜交,顯微注射,移植等技術獲得F1代雜合子小鼠(FGF13-flox-neomycin)。(2)利用Flp-deleter小鼠與FGF13-flox-neomycin小鼠交配獲得去除neomycin篩選標記基因的FGF13-flox小鼠。(3)利用myh6-Cre小鼠與FGF13-flox小鼠交配以獲得心肌表達Cre重組酶的FGF13-flox小鼠。(4)給予他莫昔芬可獲得時空調控的在心肌特異性敲除FGF13的小鼠。(5)利用實時定量PCR(q PCR)技術,蛋白免疫印跡技術和細胞免疫熒光染色技術來評價FGF13心肌組織特異性敲除小鼠的敲除效果。結果:(1)利用Cre-Lox P基因打靶原理,首先制備了FGF13-flox-neomycin F1代雜合子小鼠,然后將其與Flp-deleter小鼠交配以去除neomycin標記篩選基因,最后再將得到的FGF13-flox小鼠與心肌特異性表達Cre重組酶的myh6-Cre小鼠交配獲得在心肌特異性表達Cre重組酶的FGF13-flox小鼠,此時給予他莫昔芬后即獲得時空調控的心肌組織特異性敲除FGF13的小鼠(myh6-FGF13)。(2)通過q PCR技術檢測發現myh6-FGF13小鼠的心室肌組織中FGF13 m RNA的水平明顯降低,約為野生型的5%。(3)利用蛋白免疫印跡技術發現,與對照鼠比,FGF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌組織的表達明顯降低。(4)細胞免疫熒光技術發現,與對照鼠比,FGF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌細胞內的表達明顯降低。結論:我們成功制備FGF13-Lox P小鼠,并經與心臟表達Cre的小鼠雜交,獲得心肌條件性敲除FGF13的基因敲除小鼠,并證明FGF13基因/蛋白在小鼠心室肌中被成功敲除,提示此基因敲除小鼠可用于后續的相關研究。第二部分利用FGF13心肌條件性基因敲除小鼠研究FGF13在心律失常中的作用及其機制目的:(1)觀察FGF13是否與某種心律失常的發生有關。(2)探索FGF13引起心律失常發生的機制。方法:(1)利用整體動物體表心電圖技術肢體二導聯的方式,記錄各組小鼠的心電圖,觀測敲除心肌FGF13是否有心律失常發生。(2)應用電流鉗技術記錄小鼠心肌細胞的動作電位,觀察心肌敲除FGF13后動作電位的變化。(3)利用電壓鉗技術檢測鈉通道電流密度及門控特征的變化。結果:(1)FGF13心肌條件性敲除小鼠心電圖QRS間期顯著延長,給予氟卡尼后可誘導出Brugada綜合征特有的心電圖表型。(2)FGF13心肌條件性敲除小鼠心室肌細胞的動作電位幅度明顯降低,0期除極速率明顯減慢,50%復極時間明顯延長。(3)在FGF13心肌條件性敲除小鼠心室肌細胞鈉通道電流密度顯著降低,失活曲線向超極化方向移動,激活曲線無顯著性改變。結論:FGF13心肌條件性敲除小鼠可出現Brugada綜合癥的特征性心電圖表型,造成此病變的原因可能與敲除FGF13后可降低心室肌鈉通道電流密度,進而使動作電位幅度和上升速率降低有關,以上提示FGF13很可能是引起某種Brugada綜合征的致病基因。

【學位授予單位】：河北醫科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.7
【目錄】：

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