【摘要】：目的:腫瘤組織樣本是法醫檢案中常會遇到的一類特殊的疑難生物檢材,其本身具有基因突變的特性,且大部分都是經過福爾馬林固定石蠟包埋保存,極易發生DNA降解。而法醫學常規檢驗的STR在腫瘤組織突變率較高,且擴增片段較長容易發生等位基因丟失,使得傳統毛細管電泳檢測STR方法已不再適用于腫瘤組織的檢測。與STR相比,SNP突變率較低,擴增片段短。因此,本研究旨在探討腫瘤組織的SNP突變規律,繼而比較福爾馬林固定的降解腫瘤組織的SNP與STR的檢出率,并初步探索二代測序技術在檢測腫瘤組織中的應用價值,為法醫檢案中檢驗腫瘤組織選擇遺傳標記以及檢測技術提供基礎實驗依據。方法:1樣本采集:本實驗中所使用的樣本為本室保存的124例腫瘤組織,包括85例消化道系統、16例泌尿系統、13例呼吸系統、10例頭頸部的腫瘤組織及癌旁正常組織。所用的24例降解樣本是福爾馬林固定、-20℃保存五年的組織提取的DNA,包括12例消化道系統腫瘤組織及其癌旁正常組織。2 DNA提取:用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取上述124例腫瘤組織及正常組織DNA,采用ND-1000蛋白核酸定量儀定量。用Gene Read TM DNA FFPE試劑盒提取24例經福爾馬林固定的組織樣本DNA,采用Quantifiler?Trio DNA定量試劑盒在7500實時熒光定量PCR儀上進行定量,得到樣本濃度及降解系數。3 SNP分型:采用55個SNPs SNaPshot復合分型體系進行SNP分型,ABI 3130基因分析儀電泳,使用Gene Mapper ID v3.2軟件分析結果,得到腫瘤組織、正常組織的SNP分型。比對來自同一個體的正常組織和腫瘤組織的SNP分型結果,記錄突變的位點和突變類型。4 SNP突變位點驗證:采用單位點擴增SNaPshot、Sanger測序方法對突變位點進行驗證。5 STR分型:采用Power Plex?21試劑盒擴增降解樣本的20個常染色體STR基因座,ABI 3130基因分析儀進行電泳,使用Gene Mapper ID v3.2軟件分析結果,得到24例降解樣本的STR分型。6 STR單個基因座檢測:對疑似突變的STR基因座采用單個STR基因座進行PCR擴增,用聚丙烯酰氨凝膠電泳進行檢測。7 Miseq FGx測序:采用Foren Seq TM DNA Signature Prep試劑盒(DNA引物混合液A)在Miseq FGx測序平臺對24例降解樣本進行測序,包括27個常染色體STR、24個Y-STR、7個X-STR、94個個體識別SNP,用Foren SeqTMUAS V1.2.16347法醫分析軟件進行數據分析。8統計學分析:應用Excel、SPSS v21.0軟件對上述實驗結果進行統計學分析,用χ2檢驗比較消化道腫瘤與其他類型腫瘤之間SNP突變的差異。用直線相關對STR基因座片段大小與等位基因檢出率、樣本降解系數與等位基因檢出率進行相關性分析。用均數和標準差對Miseq FGx測序結果中STR與SNP的平均測序深度、平均雜合比值、基因座的構成比進行統計學描述。用秩和檢驗和t檢驗比較降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本之間STR與SNP測序深度、雜合比值、基因座構成比的差異。用直線相關分析方法分析STR和SNP測序深度與片段長度、測序深度與樣本降解系數的相關性。結果:1腫瘤組織的SNP突變分析85例消化道腫瘤樣本、16例泌尿系統腫瘤樣本、13例呼吸系統腫瘤樣本、10例頭頸部腫瘤樣本經SNaPshot復合分型體系分型后,共發現49個疑似突變位點。之后對49個位點進行了單位點SNaPshot驗證,結果顯示共3例樣本4個位點發生了突變,1例消化道腫瘤樣本的(rs9905977:C/T→T,rs722290:C/G→G),2例泌尿系統腫瘤樣本(rs7041158:C/T→C)(rs10092491:C/T→C),均表現為雜合性丟失。對四個位點進行Sanger測序驗證,1例泌尿系統腫瘤樣本rs7041158測序失敗,其余三個位點測序成功,均表現為雜合性丟失,與單位點SNaPshot驗證結果一致。用χ2檢驗對消化道腫瘤與其他類型腫瘤的SNP突變率差異進行比較分析,無統計學差異(P0.05)。對腫瘤組織SNP突變率與本實驗室前期檢測的STR突變率進行比較,在樣本與基因座水平SNP突變率均明顯低于STR突變率,具有統計學差異(P0.05)。2降解組織SNP與STR檢出率比較采用Quantifiler?Trio DNA定量試劑盒在7500實時熒光定量PCR儀上對24例福爾馬林固定存放五年的組織樣本DNA的降解系數及濃度進行檢測。檢測結果顯示,除1例樣本的降解系數小于1外,其余23例樣本降解系數范圍為1.01~8.57,發生不同程度的降解。此24例存放五年的組織樣本與其在福爾馬林固定24小時內提取的DNA檢測結果相比,SNP分型完全一致,檢出率為100%;而STR檢測結果顯示共發生13個基因座等位基因完全丟失,7個基因座發生等位基因雜合性丟失,這些發生等位基因丟失的樣本大部分降解較嚴重,降解系數大于2.6,且75.8%丟失等位基因的片段長度大于300bp。對STR基因座片段長度與等位基因檢出率之間進行相關性分析,呈負相關(r=-0.629,P0.05),隨著檢測片段長度增長,STR基因座檢出率逐漸下降。除兩例樣本降解系數較小卻發生等位基因丟失外,其余樣本降解系數與等位基因檢出率之間呈負相關(r=-0.659,P0.05),即DNA樣本降解系數越大,STR等位基因檢出率越低。3 Miseq FGx測序結果分析12例降解的腫瘤樣本STR基因座(Amel除外)平均測序深度為2384×(±1884×),平均雜合比值為0.61(±0.13),等位基因所占比例為0.92(0.81~1.00),stutter所占比例為0.06(0.00~0.13),noise所占比例為0.02(0.00~0.07)。12例降解的正常樣本STR基因座(Amel除外)平均測序深度為2158×(±1710×),平均雜合比值0.73(±0.11),等位基因所占比例為0.92(0.81~1.00),stutter所占比例為0.06(0.00~0.13),noise所占比例為0.02(0.00~0.07)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本在STR基因座平均測序深度、等位基因、stutter、noise所占比例均無統計學差異(P0.05),而正常樣本的基因座平均雜合比值高于腫瘤樣本,具有統計學差異(P0.05)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本STR基因座平均測序深度與基因座片段長度之間呈負相關,即隨著基因座片段長度增加,STR基因座平均測序深度降低。降解的腫瘤樣本樣本STR測序深度與樣本降解系數之間無相關性,降解正常樣本樣本STR測序深度與樣本降解系數之間呈負相關。12例降解的腫瘤樣本SNP位點平均測序深度741×(±661×),平均雜合比值0.61(±0.12),等位基因所占比例為0.9998(0.9925~1.0000),noise所占比例為0.0002(0.0000~0.0075)。12例降解的正常樣本SNP位點平均測序深度633×(±552×),平均雜合比值0.77(±0.12),等位基因所占比例為0.9995(0.9892~1.0000),noise所占比例為0.0005(0.0000~0.0108)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本SNP位點平均測序深度無統計學差異(P0.05)。SNP位點平均雜合比值、SNP位點等位基因、noise所占比例均有統計學差異(P0.05)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本SNP位點平均測序深度與SNP位點片段長度之間呈負相關,即隨著SNP位點片段長度增加,SNP位點平均測序深度降低。樣本SNP測序深度與樣本降解系數之間無相關性。24例降解樣本在Miseq測序平臺與CE平臺檢測的Power Plex?21試劑盒進行STR一致性研究。結果顯示除16例樣本共24個基因座分型結果不一致外,其余基因座檢測結果一致。有21個基因座檢測出基因亞型,3個基因座比CE多檢測出一個新的等位基因。針對降解DNA,Miseq測序平臺和CE檢測均顯示有大片段等位基因丟失現象,二者的等位基因檢出率無統計學差異(P0.05)。Miseq檢測中有Penta E和D12S391兩個基因座共30個等位基因丟失,主要表現為Penta E等位基因丟失,占未檢出等位基因的93.33%,其片段長度為362bp~467bp。CE檢測中有11個基因座共33個等位基因丟失,75.8%丟失等位基因的片段長度大于300bp。24例降解樣本進行55個SNPs的SNaPshot復合分型和Miseq測序平臺進行SNP一致性研究,兩個試劑盒共有43個相同位點。比較兩種方法的結果顯示共有5個SNPs的分型不一致,其中2個SNPs的SNaPshot分型結果丟失一個等位基因,3個SNPs的Miseq檢測結果丟失一個等位基因。兩種方法的等位基因檢出率無統計學差異(P0.05)。結論:1腫瘤組織SNP的突變率明顯低于STR,SNP更適合于腫瘤組織的個體識別和親緣鑒定。2長期福爾馬林固定的組織易發生降解,SNP比STR在降解腫瘤組織檢驗中更具優勢。3與SNPs SNaPshot分析方法相比,Miseq FGx測序平臺對于腫瘤樣本和降解檢材的檢測顯示出了更高的靈敏度,測序數據具有一定準確性和可靠性,可以作為腫瘤樣本檢測時的一個有效方法。
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【學位授予單位】：河北醫科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：D919.4

【參考文獻】

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本文編號：2423248