【摘要】：隨著年輕腫瘤患者的發(fā)病率和治愈率的不斷提高,以及放化療所帶來的不同程度的生育功能損害,年輕腫瘤病人保護和保留生育功能的訴求越來越迫切。作為增殖分化極度活躍的器官,睪丸是輻射和化療藥物的敏感靶標之一。開發(fā)一種用于防治放化療所致雄性生殖系統損傷的藥物能夠為患者提供更高的生活質量。TLR5配體鞭毛蛋白衍生物CBLB502通過TLR5依賴途徑激活NF-κB信號通路,有效地減輕電離輻射引起的造血細胞、腸道上皮細胞和血管內皮細胞的凋亡,并促進再生,是目前最有潛在價值的輻射防護藥物之一。CBLB502對多種實體腫瘤,肝毒性物質以及化療藥物引起的組織和器官損傷有廣泛的抑制作用。本文對CBLB502對輻射所致小鼠生殖系統的保護作用及機制進行了探究,并為CBLB502用于臨床上白血病的聯合治療提供了依據。第一部分:將160只C57BL/6J小鼠,隨機分為四組:正常對照組(假照射,Sham)、CBLB502單獨給藥組(502)、5 Gyγ射線照射組(5 Gy)和CBLB502預處理組(5 Gy+502);CBLB502預處理組在照射前30 min注射20 mg/kg CBLB502。在照射后第1天、3天、7天、15天、30天、60天和120天觀察小鼠的各項生殖指標。用SCA精子圖像分析系統分析附睪中精子總數和活動度,伊紅染色分析精子的畸形率。結果發(fā)現輻照后30天CBLB502預處理組明顯改善輻射引起的精子總數減少(p0.05)和活動度下降(p0.05),降低精子畸形率(p0.001)。睪丸臟器指數顯示CBLB502可以減輕睪丸體積和重量的萎縮(p0.05)。睪丸組織HE染色結果顯示輻射后睪丸病理損傷從第1天到第60天持續(xù)加重,生精小管排列完全紊亂,腔內精子消失殆盡,僅殘留支持細胞和少量精原細胞。CBLB502預處理組的損傷程度明顯減輕,第7天才可見腔內精子數量減少,第30天,生精上皮厚薄不均,排列疏松,之后便開始恢復。流式細胞術檢測睪丸內單倍體細胞比例,CBLB502預處理組明顯高于輻射對照組(53.49±2.46%vs 34.99±2.23%;p0.001)。輻照后70天(約2個小鼠生精周期)將雄性小鼠與雌鼠按照1:2的比例合籠配對,2周后CBLB502預處理與輻照組相比,雌鼠的受孕率40.0%提高到73.3%,窩仔數由4.18±1.23只/窩增加到6.13±1.41只/窩。以上結果表明,CBLB502可以提高精子的活動度和精子數量,減少精子畸形,保護睪丸組織結構完整,提高小鼠的生育能力。TUNEL檢測輻照后12 h睪丸細胞凋亡,結果顯示CBLB502預處理組小鼠每個生精小管內平均TUNEL陽性細胞數顯著低于輻射對照組(4.80±0.80 vs 8.69±0.93,p0.05),表明CBLB502能減少細胞凋亡。彗星電泳方法檢測睪丸細胞內DNA損傷,通過分析慧尾DNA比例,發(fā)現CBLB502可明顯減輕輻射所致DNA損傷(p0.01)。骨髓細胞染色體畸形率試驗顯示,CBLB502預處理組畸形率低于輻射對照組(p0.05),而且其后代染色體畸形率也明顯低于輻照組后代(p0.05),接近正常對照組比例。以上表明CBLB502預處理可以減輕DNA損傷,降低染色體畸形,減少細胞凋亡,降低遺傳毒性。試劑盒檢測輻照后4 h睪丸組織內超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。結果顯示,CBLB502預處理顯著增加睪丸組織中SOD的含量,及時清除電離產生的超氧自由基,降低脂質過氧化的產物MDA的含量,有效緩解ROS對生物膜的過氧化損傷。ELISA方法檢測血清中睪酮(T)、黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)含量。CBLB502預處理的睪酮水平是輻照對照組的2倍(p0.05),LH和FSH兩組之間沒有顯著差異。Real-time PCR結果顯示,相比于輻射對照組,CBLB502上調抑制素B(INH B)mRNA的表達,而雄激素結合蛋白(ABP)沒有明顯差異。睪酮主要由間質細胞產生分泌的,抑制素B是支持細胞的產物,表明CBLB502可以協助維持睪丸結構完整和內分泌環(huán)境的穩(wěn)定。CBLB502預處理的Tlr5基因缺失小鼠其對生殖系統的輻射保護效果明顯低于CBLB502預處理野生型的小鼠。直接證明CBLB502主要通過TLR5信號通路保護睪丸組織免受輻射損傷。利用Real-time PCR、Western blot和免疫組化的方法主要分析了NF-κB和p53相關信號通路。結果表明電離輻射激活p53,引起下游p21、Bax(促凋亡蛋白)和Caspase-3的表達上調,繼而導致細胞凋亡;而CBLB502預處理可以明顯下調這些基因和蛋白表達。CBLB502預處理小鼠顯著增強p65磷酸化,激活NF-κB信號通路,上調Bcl-2(抑凋亡蛋白)的表達。相比于輻射對照組,CBLB502明顯上調增殖細胞核抗原(PCNA)的表達,參與細胞DNA的損傷修復。第二部分:文獻提示CBLB502對造血系統具有輻射防護作用,那么CBLB502在保護骨髓造血細胞的同時,是否會保護白血病細胞或影響白血病的治療的研究顯得十分重要。為此我們利用人紅白血病K562細胞進行了探討。首先C57BL/6J小鼠在6.5 Gyγ射線全身照射前30 min,腹腔分別注射CBLB502、PBS、氨磷汀(WR2721),觀察骨髓造血祖細胞集落形成情況。結果顯示CBLB502預處理組BFU-E(爆式紅系集落形成單位)、CFU-MK(巨核細胞集落形成單位)和CFU-GM(粒細胞-單核細胞集落生成單位)的數目均明顯好于PBS和氨磷汀。CBLB502能刺激各系造血祖細胞向成熟造血細胞分化,促進造血恢復。流式細胞術和免疫印跡結果顯示K562細胞表達TLR5;MTT法測K562細胞增殖,不同濃度的CBLB502對K562細胞的增殖沒有明顯影響;在10 Gyγ射線照射和化療藥物阿糖胞苷對K562細胞處理前加入CBLB502(終濃度為200 ng/ml),結果表明CBLB502不影響γ射線照射及阿糖胞苷對K562細胞的殺傷效果。裸鼠皮下接種K562細胞后,腫瘤周圍注射CBLB502或PBS,連續(xù)14天測量腫瘤體積和重量。CBLB502從注射后第6天起腫瘤體積明顯小于PBS組(p0.05);CBLB502注射后第14天腫瘤重量顯著小于PBS組(175.83±17.32 mg vs 273.52±24.08 mg,p0.01)。我們進行了骨髓移植-重建試驗。在CD45.2+小鼠進行8.5Gy全身照射,清髓前腹腔注射CBLB502。清髓后12小時尾靜脈注射CD45.1+小鼠骨髓細胞,一個月后流式檢查骨髓細胞重建率,CBLB502與正常對照組之間沒有顯著差異。表明CBLB502對骨髓移植無影響。綜上所述,CBLB502能明顯提高輻照后精子的數量和活動度,減少精子畸形,保護睪丸組織結構完整,提高小鼠的生育能力,降低遺傳毒性。CBLB502增強抗氧化酶SOD活性,降低MDA,上調PCNA,促進DNA損傷修復。這種保護作用主要通過TLR5依賴途徑激活NF-κB通路減輕炎癥并抑制p53依賴性凋亡,下調Bax,上調Bcl-2。在白血病治療應用上,CBLB502特異性保護骨髓造血系統促進細胞分化,但不保護白血病細胞,不影響白血病細胞放化療敏感性、不影響骨髓移植,并抑制K562細胞在體內生長。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R818

【參考文獻】

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1 孫巧平;鐘進義;李蕾;崔靜;;萘乙酸誘發(fā)小鼠睪丸生精細胞損傷作用的研究(英文)[J];現代生物醫(yī)學進展;2010年03期

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本文編號：2427737