研究目的:急性骨骼肌損傷在運(yùn)動損傷中較為常見,損傷骨骼肌有強(qiáng)大的自我修復(fù)能力,但纖維沉積的速度要快于肌肉再生,在損傷較為嚴(yán)重時,骨骼肌會伴有纖維化的發(fā)生。本課題組前期研究也觀察到挫傷骨骼肌修復(fù)過程中存在纖維化現(xiàn)象,但機(jī)制尚不清楚。伴有纖維化的骨骼肌的生物力學(xué)特性較差,容易發(fā)生再次損傷,從而影響運(yùn)動能力。因此我們建立了鈍挫傷骨骼肌纖維化模型。探究各種細(xì)胞因子包括:炎癥因子、趨化因子、氧化應(yīng)激因子、Notch信號通路調(diào)節(jié)因子和巨噬細(xì)胞在損傷骨骼肌修復(fù)過程中的表達(dá)規(guī)律與骨骼肌纖維化的關(guān)系。此外,我們還探究巨噬細(xì)胞和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)在損傷骨骼肌纖維化形成過程中的作用及可能關(guān)系。研究方法:40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組(C組,n=8)骨骼肌纖維化模型組(S,n=32)。在骨骼肌鈍挫傷后3d,6d,12d和24d取小鼠雙側(cè)腓腸肌。Masson三色染色觀察挫傷骨骼肌12天和24天膠原纖維的沉積情況。熒光定量PCR檢測炎癥因子、氧化應(yīng)激因子、趨化因子、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物、Notch信號通路調(diào)節(jié)因子及轉(zhuǎn)化生長因子m RNA的表達(dá)變化規(guī)律。免疫熒光雙標(biāo)檢測轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)和共定位情況。研究結(jié)果:1.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中膠原纖維Masson染色及膠原蛋白熒光定量PCR檢測結(jié)果損傷12天和24天的小鼠骨骼肌組織對照組相比均有明顯的膠原纖維的沉積,即伴有不同程度的骨骼肌纖維化。且與第24天相比第12天膠原纖維的沉積量較高。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析顯示,Ⅰ膠原蛋白COL1A1和Ⅲ型膠原蛋白COL3A1m RNA均在骨骼肌損傷的第3天和第6天與對照組相比顯著增加(p0.01),之后迅速下降。2.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中TGF-β1與F4/80免疫熒光雙標(biāo)及熒光定量PCR檢測結(jié)果免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比損傷后的第3天TGF-β1和F4/80的表達(dá)最高之后減少24天幾乎消失。同樣發(fā)現(xiàn)重合的黃色區(qū)域也是在損傷后的第3天和第6天較為顯著,隨后下降。說明骨骼肌損傷后的第3天和第6天巨噬細(xì)胞表達(dá)了TGF-β1且表達(dá)量較高。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析顯示,TGF-β1m RNA也是在骨骼肌損傷的第3天、第6天和第12天表達(dá)量與對照組相比均顯著增加(p0.01)。巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80m RNA同樣在骨骼肌損傷的第3天和第6天表達(dá)顯著增加(p0.01),之后迅速下降。3.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中趨化因子熒光定量PCR檢測結(jié)果熒光定量PCR測定了CC家族CXC家族趨化因子的趨化性,數(shù)據(jù)顯示,CCL2m RNA在骨骼肌損傷后第3天已經(jīng)開始顯著性升高(p0.01),隨后開始下降,但第6天與第12天對照組相比仍具有顯著性差異(p0.01)。CCL5m RNA在骨骼肌損傷后第3天顯著性增加(p0.01),第6天達(dá)到最高水平,隨后m RNA水平雖有下降,但與對照組相比,第12天仍顯著增加(p0.05)。CCR2m RNA在骨骼肌損傷后第3天顯著性增加(p0.01),隨后m RNA水平雖有下降,但第6天和第12天對照組相比,仍顯著增加(p0.01,p0.05)。CXCL12僅在傷后第3天表達(dá)與對照組相比顯著增加(p0.01),隨后迅速下降。CXCR4m RNA在傷后第3天,第6天表達(dá)與對照組相比均顯著增加(p0.01),第3天達(dá)到峰值隨后開始下降。4.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中炎癥因子熒光定量PCR檢測結(jié)果熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)測定了炎癥因子的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示,炎癥因子TWEAK m RNA在骨骼肌損傷后第3天和第6天與對照組相比表達(dá)均顯著性增加(p0.01)。TWEAK受體Fin14在骨骼肌損傷后第3天表達(dá)顯著增加(p0.01),之后逐漸下降。5.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中氧化應(yīng)激因子熒光定量PCR檢測結(jié)果熒光定量PCR結(jié)果顯示,氧化應(yīng)激因子gp91m RNA(NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基)在傷后第3天和第6天表達(dá)量與對照組相比均顯著增加,且在損傷后第3天達(dá)到峰值(p0.01),隨后開始下降。6.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中Notch信號通路調(diào)節(jié)因子熒光定量PCR檢測結(jié)果熒光定量PCR的結(jié)果顯示Hes1m RNA在骨骼肌損傷后的第3天和第6天與對照組相比顯著增加。Hey1m RNA在骨骼肌損傷后的第3天和第6天也顯著增加,之后下降。Hey2m RNA僅在第12天與對照組相比有顯著增加。Hey Lm RNA僅在骨骼肌損傷的第6天顯著增加之后迅速下降。研究結(jié)論:(1)骨骼肌損傷修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤過量增加可能對損傷骨骼肌纖維化的形成發(fā)揮重要作用。此外,骨骼肌修復(fù)期間,巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1可能促進(jìn)了損傷骨骼肌纖維化的發(fā)生。(2)挫傷骨骼肌纖維化形成過程中Notch信號通路調(diào)節(jié)因子Hes1,Hey1,Hey2,Hey L;炎癥因子TWEAK/Fn14;氧化應(yīng)激因子gp91-phox;趨化因子CCL2,CCL5,CCR2,CXCR4,CXCL12均高水平表達(dá),這些因子可能參與了損傷骨骼肌纖維化的形成。
【學(xué)位單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R87
【部分圖文】：

挫傷骨骼肌纖維化的發(fā)生機(jī)制研究3.材料與方法3.1 材料3.1.1 實(shí)驗(yàn)對象與分組40只SPF級8周齡健康C57BL/6雄性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司小鼠體重都約 18—25g。將 40 只小鼠隨機(jī)分為鈍挫傷纖維化模型組即 S 組(32 只和未損傷對照組即 C 組(8 只)。損傷纖維化模型組根據(jù)取材時間點(diǎn)不同分為3d,6d,12d,24d 四個組，每組每個時間點(diǎn) 8 只。3.1.2 技術(shù)路線

圖 2 損傷骨骼肌組織 Masson 三色染色結(jié)果比較膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色；肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色；細(xì)胞核呈藍(lán)黑色損傷12天和24天的小鼠骨骼肌組織與對照組相比均有明顯的膠原纖維的沉積表明挫傷骨骼肌發(fā)生了纖維化。且與第 24 天相比第 12 天膠原纖維的沉積量較高。圖 3 損傷骨骼肌修復(fù)過程中膠原蛋白 mRNA 表達(dá)規(guī)律（與對照組相比，*p<0.05,**p<0.01）熒光定量 PCR 數(shù)據(jù)分析顯示，Ⅰ型膠原蛋白 COL1A1 和Ⅲ型膠原蛋白

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 損傷骨骼肌修復(fù)過程中 Masson 三色染色結(jié)果及膠原蛋白 mRNA 表達(dá)圖 2 損傷骨骼肌組織 Masson 三色染色結(jié)果比較膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色；肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色；細(xì)胞核呈藍(lán)黑色損傷12天和24天的小鼠骨骼肌組織與對照組相比均有明顯的膠原纖維的沉積表明挫傷骨骼肌發(fā)生了纖維化。且與第 24 天相比第 12 天膠原纖維的沉積量
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本文編號：2887590