目的:Tourette綜合征是一種起病于兒童時(shí)期,以多發(fā)性運(yùn)動(dòng)抽動(dòng)伴有一種或多種發(fā)聲抽動(dòng)為主要臨床特點(diǎn)的神經(jīng)精神障礙性疾病。近年來(lái)有關(guān)谷氨酸受體基因家族與該病的相關(guān)性被關(guān)注,研究證明多種谷氨酸受體基因參與Tourette綜合征的發(fā)病機(jī)制,而GRIN3B基因是谷氨酸受體基因家族中的一個(gè)主要成員,本研究的目的是對(duì)該基因編碼區(qū)突變進(jìn)行研究,明確該基因與Tourette綜合征的相關(guān)性。方法:本研究通過(guò)采用illumina二代測(cè)序的方法對(duì)GRIN3B基因的全部外顯子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序分析;結(jié)合測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)分析,初步篩選TS患者GRIN3B可能與TS相關(guān)的突變位點(diǎn)及類(lèi)型;然后將二代測(cè)序初選出的位點(diǎn)用一代測(cè)序在相應(yīng)樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。其中選取51例Tourette綜合征患兒及60例健康對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組選取2015年10月至2016年11月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院的51例年齡范圍在6-16歲的TS患兒,平均年齡9.78±3.64歲,其中男孩41例(80.4%),女孩10例(19.6%);入選標(biāo)準(zhǔn)為:(1)在疾病的某段時(shí)間內(nèi)存在多種運(yùn)動(dòng)和一個(gè)或更多的發(fā)聲抽動(dòng),盡管不一定同時(shí)出現(xiàn);(2)抽動(dòng)的頻率可以有強(qiáng)有弱,但自第一次抽動(dòng)發(fā)生起持續(xù)超過(guò)一年;(3)18歲前發(fā)病;(4)這種障礙不能歸因于某種物質(zhì)(例如可卡因)的生理效應(yīng)或其他軀體疾病。健康對(duì)照組選取年齡在22-45歲范圍內(nèi)的健康體檢者,平均年齡29.08±2.89歲,其中男性49例(81.7%),女性11例(18.3%)。選擇標(biāo)準(zhǔn)為:(1)無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)和精神疾病及其它重大軀體疾病;(2)無(wú)神經(jīng)、精神疾病家族史;(3)自愿參與此次臨床試驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)的健康體檢者。提取兩組的血液基因組DNA,設(shè)計(jì)GRIN3B基因片段引物,然后對(duì)GRIN3B基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用Sanger測(cè)序法對(duì)每一個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與對(duì)照組及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GRIN3B基因編碼區(qū)原序列(NM_138690.2)進(jìn)行比對(duì),檢測(cè)這些患兒是否攜帶GRIN3B基因突變。結(jié)果:本研究通過(guò)Sanger測(cè)序法對(duì)TS組及對(duì)照組的GRIN3B基因進(jìn)行突變研究,結(jié)果在TS組發(fā)現(xiàn)兩個(gè)非同義變異位點(diǎn)p.P154S和p.L396S,其中rs113181909位點(diǎn)變異(c.C460T)導(dǎo)致脯氨酸突變成絲氨酸(p.P154S),該氨基酸位于高度保守序列。rs12978900位點(diǎn)變異(c.T1187C)導(dǎo)致亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸(p.L396S),但該氨基酸位于非保守序列,而對(duì)照組rs113181909和rs12978900未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的變異。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),位于GRIN3B蛋白第154位密碼子編碼的脯氨酸變?yōu)榻z氨酸(p.P154S),第396位密碼子編碼的亮氨酸變?yōu)榻z氨酸(p.L396S)。同時(shí),利用DNAMAN軟件將人、牛、小鼠、綿羊、大白鼠以及野豬的GRIN3B蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)第154位氨基酸位于保守區(qū)內(nèi),而位于第396位的氨基酸位于非保守區(qū)域。結(jié)論:在2例患者中發(fā)現(xiàn)了GRIN3B基因c.C460T(p.P154S)變體;在10例患者中發(fā)現(xiàn)GRIN3B基因c.T1187C(p.L396S)變體,并通過(guò)Sanger測(cè)序的方法驗(yàn)證,得到雙峰變異測(cè)序圖。兩個(gè)GRIN3B變異位點(diǎn)均導(dǎo)致該編碼蛋白的改變,但有關(guān)GRIN3B基因變異導(dǎo)致Tourette綜合征的具體機(jī)制尚不明確。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R749.94
【部分圖文】：

8第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(見(jiàn)圖1)圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖（注：泳道1為Marker I，自上到下分別為：700bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp;其他泳道自左到右分別為GRIN3B 1-9 的PCR產(chǎn)物,其中泳道2-3為外顯子1、2的PCR產(chǎn)物；泳道4-6為GRIN3B外顯子3的3個(gè)片段的PCR產(chǎn)物；7-12泳道為4-9外顯子PCR產(chǎn)物)3.2 Sanger測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩例GRIN3B基因c.460C＞T（圖2A）變異和一例c.1187T＞C（圖2B）變異

圖2 Sanger測(cè)序結(jié)果到下為：GRIN3B基因c.460C＞T, p.P154S，健康人GRIN3B基因序列；B:自上到下為：GRIN3B基因.L396S，健康人GRIN3B基因序列)生物信息學(xué)分析結(jié)果生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，位于GRIN3B蛋白第154位密碼子編碼的脯氨酸p.P154S），第396位密碼子編碼的亮氨酸變?yōu)榻z氨酸（p.L396S）。同AMAN軟件將人、牛、小鼠、綿羊、大白鼠以及野豬的GRIN3B蛋白進(jìn)對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第154位氨基酸位于保守區(qū)內(nèi)，而位于第396位的氨基酸域(見(jiàn)圖3)。

圖2 Sanger測(cè)序結(jié)果(A:自上到下為：GRIN3B基因c.460C＞T, p.P154S，健康人GRIN3B基因序列；B:自上到下為：GRIN3B基因c.1187T＞C, p.L396S，健康人GRIN3B基因序列)3.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，位于GRIN3B蛋白第154位密碼子編碼的脯氨酸變?yōu)榻z氨酸（p.P154S），第396位密碼子編碼的亮氨酸變?yōu)榻z氨酸（p.L396S）。同時(shí)，利用DNAMAN軟件將人、牛、小鼠、綿羊、大白鼠以及野豬的GRIN3B蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第154位氨基酸位于保守區(qū)內(nèi)，而位于第396位的氨基酸位于非保守區(qū)域(見(jiàn)圖3)。A
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2890932