大黃魚(Larimichthys crocea)是我國特有的最重要的海水經濟魚類之一,在生長上存在性別二態性,但是目前對其性別決定機制的了解還比較欠缺。對大黃魚性別決定關鍵基因的研究,有助于今后繁殖生產和育種工作的開展。本研究從在大黃魚精巢特異性表達的Dmrt1基因入手,克隆了其全長cDNA及X和Y染色體上Dmrt1基因(分別稱為LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y)的啟動子序列,構建了該基因的表達載體注射到青鳉受精卵觀察其表達和對青鳉性別發育的影響,并通過構建熒光素酶報告基因載體,對啟動子活性區域進行了初步分析。主要研究結果如下:1、通過RACE技術獲得了大黃魚Dmrt1基因(LcDmrt1)的全長cDNA序列,共3037bp,其中包括918 bp的ORF,132 bp的5’UTR和1932 bp的3’UTR。以大黃魚BAC文庫中包含Dmrt1基因的X和Y染色體片段的單克隆為模板擴增了Dmrt1基因啟動子區的核苷酸序列,發現兩者之間存在許多SNP和插入缺失變異。生物信息學軟件預測的結果表明,LcDmrt1的啟動區存在多個轉錄因子結合位點,包括TATA結合蛋白(TBP)、SMAD2以及性別相關蛋白SOX家族成員(SOX5、SOX10、SOX17)和SRY等結合位點;其中,LcDmrt1~Y在-1375 bp處含有1個特異的TBP結合位點,LcDmrt1~X在-1813 bp處和在-2416bp處分別有一個特異的SOX5結合位點和SRY結合位點。此外,LcDmrt1~Y在啟動子區還含有2個DMRT1結合位點,分別位于-1040 bp和-287 bp處,而LcDmrt1~X有3個DMRT1的結合位點,分別位于-1820 bp,-1048 bp和-298 bp處,其中-1820處的DMRT1結合位點是X染色體特異的。2、利用克隆的大黃魚Dmrt1全長cDNA成功構建了PCS2-LcDmrt1過表達載體,利用顯微注射技術導入模式魚青鳉受精卵中,觀察LcDmrt1在青鳉體內的基因整合、表達和對青鳉性別發育的影響。結果表明,注射48 h后,LcDmrt1基因在青鳉胚胎內大量表達,孵化后40 d的稚魚中LcDmrt1的整合率為24.3%,并觀察到1尾遺傳型為XX的青鳉發育成了雄魚,表明LcDmrt1具有誘導青鳉雌魚性腺分化發育成精巢的作用。3、構建了含有LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y不同長度啟動子序列的雙熒光素酶報告載體Pro-D2K-X(-1983,+133)、Pro-D2K-Y(-1975,+133)、Pro-D700-X(-615,+133)和Pro-D700-Y(-607,+133)。分別共轉染人胚胎腎細胞系(HEK-293)檢測其表達活性。結果表明,LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y啟動子都有活性,LcDmrt1~Y的啟動子活性高于LcDmrt1~X的啟動子。將上述4種啟動子活性分析質粒分別與PCS2-LcDmrt1共轉染,觀察LcDmrt1是否有自我反饋的調節機制。結果表明,過表達LcDmrt1會降低啟動子活性,說明大黃魚DMRT1具有具有負反饋調節作用,結合LcDmrt1~Y啟動子的表達活性明顯高于LcDmrt1~X的結果分析,表明LcDmrt1的抑制程度可能與其啟動子區DMRT1結合位點數目有關,其中包含3個DMRT1結合位點的LcDmrt1~X的啟動子活性受到抑制的程度明顯高于2個結合位點的LcDmrt1~Y啟動子。此外,LcDmrt1~Y的這種自我抑制作用具有劑量效應,具有2個DMRT1結合位點的Pro-D2K-Y啟動子活性受到抑制的程度顯著高于只有1個DMRT1結合位點的Pro-D700-Y的啟動子活性(p0.05);而LcDmrt1~X的結果正好相反,共轉染后Pro-D700-X表達活性下降幅度極顯著大于Pro-D2K-X,暗示(-615 bp,0)區域中的結合位點可能是該啟動子接受DMRT1的負反饋調節的主要位點。本研究獲得了大黃魚Dmrt1基因cDNA全長序列和X與Y染色體上該基因的啟動子序列,并成功構建了一系列表達質粒,初步揭示了DMRT1的功能及X、Y染色體上LcDmrt1啟動子的表達特性,研究結果為闡明大黃魚性別決定與分化的分子機制,提供了良好的基礎和有價值的研究資料。
【學位單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 魚類性別決定與分化
        1.1.1 遺傳型性別決定（GSD）
        1.1.2 環境型性別決定（ESD）
    1.2 性別決定基因的研究進展
        1.2.1 Sox基因家族
        1.2.2 Dmrt基因家族
        1.2.3 芳香化酶基因
        1.2.4 Vasa基因
        1.2.5 其他性別分化相關基因
    1.3 啟動子的研究進展
    1.4 大黃魚性別研究背景
        1.4.1 大黃魚簡介
        1.4.2 大黃魚性腺發育和性別分化的研究
        1.4.3 大黃魚性別相關基因的研究
    1.5 本研究的目的及意義
第2章 大黃魚Dmrt1基因全長cDNA和啟動子的克隆與分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗樣品
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設備
        2.1.4 培養基配制
        2.1.5 常用溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基因組DNA提取
        2.2.2 大黃魚個體遺傳性別鑒定
        2.2.3 大黃魚精巢總RNA提取
        2.2.4 大黃魚Dmrt1基因3’和5’端序列的克隆
        2.2.5 大黃魚Dmrt1基因啟動子序列克隆及分析
    2.3 結果與分析
        2.3.1 大黃魚遺傳性別鑒定
        2.3.2 大黃魚Dmrt1基因3’RACE和5’RACE結果
        2.3.3 Dmrt1基因啟動子序列的克隆與分析結果
    2.4 討論
第3章 大黃魚Dmrt1基因在青鳉的表達及其效應
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗樣品
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 大黃魚Dmrt1基因cDNA第一條鏈合成
        3.2.2 大黃魚Dmrt1基因cDNA第一條鏈的檢測
        3.2.3 大黃魚Dmrt1基因過表達載體構建
    3.3 結果
        3.3.1 大黃魚Dmrt1基因CDS全長擴增
        3.3.2 大黃魚Dmrt1基因表達載體構建
        3.3.3 注射后青鳉胚胎的RFP表達情況
        3.3.4 大黃魚Dmrt1表達載體在青鳉體內整合情況
    3.4 討論
第4章 大黃魚Dmrt1基因啟動子的活性分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗樣品
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 LcDmrt1不同長度啟動子片段質粒的構建和活性分析
    4.3 結果與分析
        4.3.1 LcDmrt1不同長度啟動子片段質粒的構建
        4.3.2 LcDmrt1不同長度啟動子片段質粒的活性測定
        4.3.3 LcDmrt1對LcDmrt1啟動子活性影響
    4.4 討論
第5章 結論與展望
    5.1 研究結論
    5.2 創新點
    5.3 展望
致謝
參考文獻
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本文編號：2890958